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Type: DISSERTAÇÃO
Degree Level: Mestrado
Title: Desenvolvimento de uma tecnica imunoenzimatica (Elisa) rapida e quantitativa para o imunodiagnostico da doença de Chagas
Author: Partel, Claudia Dambroski
Advisor: Rossi, Claudio Lucio, 1950-
Abstract: Resumo: A Doença de Chagas, infecção causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, em pessoas imunocompetentes é, geralmente, assintomática ou se apresenta associada com manifestações clínicas leves e não específicas. Os pacientes com infecção crônica podem apresentar anormalidades cardíacas e/ou digestivas severas, mas estas manifestações clínicas são, usualmente, precedidas por muitos anos de infecção assintomática. Deste modo, a suspeita clínica da infecção, além de levar em consideração aspectos epidemiológicos, deve ser confirmada por dados laboratoriais. O diagnóstico da fase crônica da infecção chagásica é, geralmente, baseado na presença de níveis significativos de anticorpos específicos, desde que a detecção de parasitas circulantes é, frequentemente, dificil, em consequência dos baixos níveis de parasitemia. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de uma técnica imunoenzimática (ELISA) rápida e quantitativa para o imunodiagnóstico da Doença de Chagas. Considerando que o desempenho de uma técnica imunológica depende, em grande parte, da preparação antigênica utilizada, o extrato bruto de T.cruzi foi fracionado por cromatografias de afinidade (Sepharose 4B-Ientil-Iectina) e de troca iônica (DEAESephacel), na tentativa de se encontrar frações com alta atividade antigênica específica e baixa reatividade cruzada. Uma fração do parasita obtida por cromatografia em DEAESephacel foi selecionada com base na reatividade apresentada com soros de pacientes com Doença de Chagas e leishmaniose. A técnica ELISA foi padronizada utilizando um sistema comercial para reações imunoenzimáticas - "falcon assay screening test" (FAST -ELISA). Este sistema é constituído por placas apropriadas para todos os pàssos da reação, incluindo uma placa que possui uma tampa de plástico onde estão fixadas 96 esferas de poliestireno que se encaixam nos orificios de placas de microtitulação. Na realização do teste, a tampa com esferas revestidas com a preparação antigênica de T.cruzi foi transferi da., sucessivamente, após as lavagens necessárias, para as placas contendo as amostras de soros sendo testadas, o conjugado (anti-IgG humana marcada' com peroxidase) e o sistema substrato (tetrametilbenzidina/peróxido de hidrogênio). Nas incubações com os soros, conjugado e substrato (5 minutos cada, à temperatura ambiente) as placas foram colocadas sobre um aparelho com movimentos orbitais e agitadas continuamente. As absorbâncias das reações foram medidas a 630 nm na placa contendo o substrato. Em todos os ensaios, foram inclui dos soros padrões contendo concentrações conhecidas de anticorpos anti-T.crozi, em termos de unidades de atividade por ml (V/ml). Cada soro foi testado em triplicata e a absorbância média foi transformada em U/ml utilizando a curva padrão. Em um estudo comparativo, anticorpos IgG anti-T.crozi foram pesquisados com as técnicas de ELISA e IFI em 50 pacientes chagásicos crônicos, 58 pacientes com infecções heterólogas e em 20 pessoas sadias. A técnica ELISA apresentou sensibilidade de 98% e especificidade de 99%, enquanto que a sensibilidade e a especificidade obtidas com a reação de IFI foram, respectivamente, 92% e 96%. O bom desempenho, em termos de sensibilidade e especificidade, mais a simplicidade e rapidez, evidenciam que a técnica de ELISA, por nós desenvolvida, pode ser de grande utilidade para o imunodiagnóstico da Doença de Chagas

Abstract: Chagas' disease, an infection caused by the parasite Trypanosoma crnzi, is generally asymptomatic or is associated with mild, non-specific clinical manifestations in immunocompetent subjects. Severe cardiac and/or digestive system abnorrnalities may develop in chronically infected patients, but these clinical manifestations are usually preceded by many years of asymptomatic infection. For this reason, the clinical diagnosis should always be considered in an epidemiological context and confirrned by laboratory data. The diagnosis of chronic Chagas' disease is generally based on detecting specific antibodies, since the detection of circulating parasites is often difficult in view of the low levels of parasitemia. The purpose of this study was to develop a rapid and quantitative enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) for the immunodiagnosis of Chagas' disease. Considering that the perforrnance of an immunological technique is highly dependent on the antigen used, a T.crnzi crude extract was fractionated by affinity chromatography (Sepharose 4B-lentil lectin) and ionic exchange chromatography (DEAE-Sephacel) in an attempt to identify fractions with both a high specific antigenic activity and a low cross reactivity. One fraction of the parasite extract obtained by chromatography on DEAE Sephacel was selected for further study based.on its reactivity with sera from patients with Chagas' disease and leishmaniasis. The ELISA procedure was standardized using the Falcon assay screening test (FAST-ELISA
Subject: Chagas, Doença de
Imunodiagnostico
Imunoglobulinas
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 1996
Appears in Collections:FCM - Tese e Dissertação

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