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Type: TESE
Degree Level: Doutorado
Title: Avaliação dos efeitos da inibição da via Rho/Rho-quinase na adesão dos eosinófilos de pacientes com anemia falciforme e no modelo de inflamação pulmonar em camundongos com anemia falciforme
Title Alternative: Evaluation of the efects of inhibition Rho/Rho-kinase pathway on eosinophils from sickle cell Anemia patients and lung inflammation in sickle cell anemia mice model
Author: Pallis, Flávia Rubia, 1986-
Advisor: Penteado, Carla Fernanda Franco
Abstract: Resumo: A vaso-oclusão compreende um processo complexo e multicelular iniciado pela adesão de hemácias e leucócitos ao endotélio ativado, causando a obstrução vascular, ativação de células endoteliais vasculares e lesões que podem induzir uma resposta inflamatória contínua na anemia falciforme (AF). Estudos preliminares mostraram que os eosinófilos de pacientes com AF encontram-se ativados no sangue periférico, porém o envolvimento dessa célula no processo de vaso-oclusão ainda não está bem caracterizado. Pouco se sabe sobre o papel das proteínas da via das Rho GTPases na adesão dos eosinófilos ao endotélio vascular, bem como nas complicações pulmonares da doença. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro o papel dos eosinófilos e das proteínas pertencentes à família das Rho GTPases na fisiopatologia da AF, e avaliar in vivo o papel dessa via na resposta inflamatória pulmonar induzida pela OVA em camundongos com AF. Sangue periférico de indivíduos saudáveis (controles) e pacientes com AF, em terapia com hidroxiureia (SSHU) ou não (SS), foi coletado para avaliar a adesão estática e em fluxo. A adesão dos eosinófilos de pacientes com AF à HUVEC estimulada com TNF-'alfa' foi significativamente maior quando comparado a adesão dos eosinófilos á HUVEC de indivíduos controle, em condições de fluxo e estática. No entanto, a adesão dessas células à HUVEC estimulada com TNF-? foi menor nos pacientes SSHU, quando comparada com o com aos SS. O pré-tratamento das HUVEC com o inibidor de Rac1, reduziu a adesão dos eosinófilos de pacientes SS ou SSHU. Em condições de fluxo, o número de eosinófilos aderidos à HUVEC reduziu significativamente quando estas foram tratadas com Y-27632 ou NSC23766 nos três grupos avaliados, porém essa inibição foi maior no grupo SS. In vivo a OVA induziu inflamação pulmonar caracterizada pelo aumento na contagem de leucócitos, principalmente eosinófilos, no lavado broncoalveolar dos camundongos. Essa inflamação foi potencializada nos camundongos com AF (Berkeley e Transplantados) quando comparados aos controles (C57BL6). Os camundongos Transplantados apresentaram níveis elevados de mediadores pró-inflamatórios, tais como, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, RANTES, Eotaxina, MCP-1, MMP-9 e TIMP-1 quando comparados aos camundongos do grupo não sensibilizado (NS). Nenhuma diferença foi observada nos níves de RNAm pulmonar das metaloproteinases e seus inibidores quando comparados os camundongos Transplantados do grupo OVA com os NS, porém a expressão de IL-6 é significativamente maior no pulmão dos animais falciformes desafiados com OVA. Na avaliação funcional dos brônquios, os dados mostraram que a potência para metacolina foi maior nos camundongos Berkeley, quando comparados aos Transplantados e ainda maior quando comparados com os C57BL6. Os animais que foram tratados com os inibidores da via RhoA/ROCK, Y-27632 ou Fasudil, apresentaram menor contagem total e diferencial das células que migraram para os pulmões e níveis reduzidos dos mediadores pró-inflamatórios avaliados. O pré-tratamento com o Fasudil reduziu a potência e a resposta máxima para metacolina dos brônquios da linhagem Berkeley. Não foi observada diferença na avaliação funcional da reatividade da traqueia no modelo de asma experimental nos grupos avaliados. Tomados em conjunto, os resultados indicam que a via RhoA/ROCK tem papel importante na adesão dos eosinófilos ao endotélio e que a inibição dessa via pode atenuar a asma associada a doença falciforme. Deste modo, sugerimos que os inibidores dessa via podem ser novos agentes terapêuticos para o tratamento das manifestações clínicas da AF

Abstract: Vaso-occlusion, comprising a complex and multicellular process, initiated by the adhesion of erythrocytes and leukocytes to the activated endothelium, leading to vascular obstruction, activation of vascular endothelial cells and continuous lesions in patients with sickle cell anemia (SCA). Preliminary results demonstrated that eosinophils from SCA patients exist in an activated state, however the participation of this cell in the vasooclusive process in not well establish. The role of proteins via the Rho GTPases in the adhesion of eosinophils to the vascular endothelium and in the pulmonary complications of SCA disease it is unknown. The aim of this study was to evaluate in vitro the role of the eosinophils and proteins belonging to the Rho GTPases family in SCA pathophysiology, and evaluate in vivo the role of this pathway in pulmonary inflammatory responses induced by OVA in SCA mice. Peripheral blood of healthy individuals (controls) and SCA patients in therapy or not with hydroxyurea (SCAHU) was collected for static and flow adhesion experiments. For static adhesion assays, eosinophils were isolated from control subjects or SCA patients on or off HU therapy. Adhesion of SCA eosinophils to HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) under TNF-'alfa'-stimulated conditions was higher when compared with control eosinophils, in flow conditions and static assay. Furthermore, SCAHU eosinophils demonstrated significantly lower adhesive properties, compared to SCA eosinophils. The adhesion of eosinophils from SCA or SCAHU patients were reduced when HUVEC were pretreated with NSC23766 inhibitor, compared to non-treated HUVEC. Under flow conditions, the number of eosinophils adhered to HUVEC cells was reduced when they were treated with Y-27632 or NSC23766 in the three groups investigated, however this inhibition was higher in the SCA patients. In vivo OVA induced lung inflammation, characterized by increased leukocyte particularly eosinophils, counts in the mice bronchoalveolar fuid (BALF). This inflammation was enhanced in SCA mice (Berkeley and Transplanted) when compared to controls (C57BL6). Transplanted mice showed high levels of pro-inflammatory mediators such as IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, RANTES, Eotaxin, MCP-1, MMP-9 and TIMP-1 as compared to the control mice group (NS). Furthermore, the SCA mice induced with OVA showed higher lung gene expression of IL-6; however, there was no difference in the expression of MMP-2, MMP-8, MMP-9, MMP-12, TIMP-1 and TIMP-2, compared to NS. In the functional assessment of the bronchi reactivy, data showed that the potency to methacholine in asthmatic model was was greater in the SCA mice (Berkeley), compared to the Transplanted SCA mice, and even greater when compared to C57BL6. The animals treated with the inhibitors of the RhoA/ROCK pathway, Y-27632 or Fasudil, showed lower total and differential cells counts due to migration to the lungs. Pretreatment with the RhoA/ROCK pathway inhibitor significantly reduced the proinflammatory mediator levels evaluated. Treatment with Fasudil reduced maximal response for methacholine in bronchi from Berkeley model. No significant difference was observed in the tracheal reactivity after OVA challenge in all groups investigated. Taken together, our data indicated that RhoA/ROCK pathway play an important role in the eosinophil adhesion to the endothelium and, the inhibition of this pathway could alleviates asthma in SCA patients. Thus, we suggest that RhoA/ROCK inhibitors represents novel therapeutic agents for the treatment of SCA clinical manifestations
Subject: Anemia falciforme
Eosinófilos
Proteínas rho de ligação ao GTP
Editor: [s.n.]
Citation: PALLIS, Flávia Rubia. Avaliação dos efeitos da inibição da via Rho/Rho-quinase na adesão dos eosinófilos de pacientes com anemia falciforme e no modelo de inflamação pulmonar em camundongos com anemia falciforme. 2015. 124 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/308493>. Acesso em: 26 ago. 2018.
Date Issue: 2015
Appears in Collections:FCM - Tese e Dissertação

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