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Type: TESE
Title: Estudo das vias de sinalização envolvidas na ativação da NADPH oxidase e na inibição da agregação plaquetária na sepse experimental
Title Alternative: Study of signaling pathways involved in the activation of NADPH oxidase and inhibiton of platelets aggregation in experimental sepsis
Author: Lopes-Pires, Maria Elisa, 1980-
Advisor: Marcondes, Sisi, 1966-
Paschoal, Sisi Marcondes, 1966-
Abstract: Resumo: A sepse e ainda causa de muitos óbitos em hospitais do mundo todo. A gravidade da sepse esta relacionada ao estado de ativação de plaquetas. Trabalho prévio do nosso grupo mostrou que o tratamento de ratos com lipopolissacarideo (LPS) leva a inibição da agregação plaquetaria e aumento da formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) via NADPH oxidase. Entretanto, o efeito inibitório do LPS na agregação não e dependente da liberação de EROs. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar as vias de sinalização envolvidas na inibição da agregação e na ativação da NADPH oxidase em plaquetas de ratos tratados com LPS. Para tanto, ratos Wistar machos foram injetados com LPS (1 mg/kg, i.p.) e apos 6h ou 48h o sangue foi coletado. A agregação plaquetaria foi induzida por ADP (10 ?M) na ausência e na presença de diferentes inibidores enzimáticos. A formação de EROs em plaquetas foi determinada por citometria de fluxo utilizando a sonda fluorescente DCFH-DA e a concentração intraplaquetaria de GMPc por imunoensaio. Também foram realizados ensaios de western blotting para a analise da ativação das enzimas c-Src, AKT e NADPH oxidase, bem como para a detecção de proteínas contendo resíduos de nitrotirosina. A analise do western blotting mostrou que a fosforização da c-Src quinase no resíduo Tyr 416, que indica ativação da enzima, foi semelhante em plaquetas de ratos injetados com salina ou LPS em 6h ou 48h. Alem disso, a inibição de Src com PP2 (10 ?M) não modificou a agregação plaquetaria de ratos tratados com LPS. Nos verificamos que a inibição da agregação foi acompanhada por um aumento significativo dos níveis de GMPc, bem como da nitracao de proteínas, em plaquetas de ratos 6h ou 48h apos o tratamento com LPS. A incubação das plaquetas com o sequestrador de peroxinitrito -(-) epigalocatequina gallato (10 ?M) aumentou significativamente a agregação de ratos injetados com LPS em 48h, mas não alterou a agregação em 6h. Entretanto, a inibição da agregação plaquetaria em ratos tratados com LPS em 6h foi revertida pelo inibidor da enzima guanilil ciclase ODQ (25 ?M) ou pelo inibidor de PKG Rp-8-Br (25 ?M). De forma semelhante, o inibidor nao seletivo de PKC GF109203X (10 ?M) reverteu o efeito inibitório do LPS em 6h na agregação e reduziu os niveis de GMPc em plaquetas. Nos mostramos que a fosforização da AKT no resíduo Thr308 foi significativamente maior em plaquetas de ratos tratados com LPS quando comparado com ratos injetados com salina. A incubacao das plaquetas de ratos tratados com LPS com o inibidor de PI3K wortmannin (100 nM) nao modificou a agregação. Entretanto, o inibidor da AKT PPI-1 (20 ?M) aumentou a agregação para níveis semelhantes aos observados nos ratos injetados com salina. A agregação plaquetaria de ratos 48h apos o tratamento com LPS não foi afetada por nenhum dos inibidores enzimáticos utilizados neste trabalho. O aumento da geração de EROs em plaquetas de ratos tratados com LPS em 6h ou 48h foi acompanhado pelo aumento significativo da fosforização do resíduo Ser345 na subunidade p47-phox da NADPH oxidase. A incubação de plaquetas de ratos tratados com LPS com GF109203X inibiu a fosforização da p47-phox bem como reduziu a geração de EROS. A produção aumentada de EROs em plaquetas de ratos tratados com LPS em 6h também foi reduzida em 42% por PP2. A inibição de PI3K ou AKT não modificou a produção de EROS em plaquetas de ratos tratados com LPS. A incubação de plaquetas com ODQ ou com Rp-8-Br (5?M) reduziu significativamente a produção de EROS somente em plaquetas de ratos 48h apos o tratamento com LPS. Portanto, no presente trabalho podemos concluir que a inibição da agregação plaquetaria observada 6h apos a injeção de LPS e mediada pela via NO/GMPc/PKG e também e modulada pela PKC e AKT, enquanto que, o efeito inibitório do LPS em 48h e essencialmente dependente da formação de peroxinitrito. A produção aumentada de EROs em plaquetas de ratos tratados com LPS envolve a fosforização da subunidade p47-phox da NADPH oxidase pela PKC. Alem da PKC, são importantes no aumento da liberação de EROs em plaquetas a Src em 6h e a via GMPc/PKG em 48h apos a injeção de LPS

Abstract: Sepsis is still a cause of high mortality in hospitals all over the world and its severity is directly related to platelet activity. A previous work of our group showed that the treatment of rats with lipopolysaccharide (LPS) inhibited platelet aggregation and also increased reactive oxygen species (ROS) production which was mediated especially by NADPH oxidase. However, the inhibitory effect of LPS on platelet aggregation is independent of ROS formation. Therefore, in the present work we investigated the signaling pathways involved in the aggregation inhibition as well as in the increased ROS formation in platelets of LPS-treated rats. Male Wistar rats were injected with LPS (1 mg/kg, i.p.) and blood was collected after 6h or 48h. Platelet aggregation was induced by ADP (10 ?M) in the absence or in the presence of different enzymatic inhibitors. ROS formation in platelets was determined through flow cytometry using 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFHDA) and cGMP intraplatelet levels by enzyme immunoassay kit. Western blotting assays were carried out to analyze AKT and NADPH oxidase activation and the presence of nitrated proteins in platelets. In the present work, we observed that the inhibition of aggregation was accompanied by a significant increase of cGMP levels as well as protein nitration in platelets of LPS-treated rats. Incubation of platelets with the peroxynitrite scavenger -(-) epigallocatechingallate (10 ?M) significantly increased aggregation of LPS-treated rats at 48h, but did not modify it at 6h. However, the inhibitory effect of LPS at 6h on platelet aggregation was reversed by the guanylyl cyclase (sGC) inhibitor ODQ (25 ?M) or by the PKG inhibitor Rp-8-Br (25 ?M). Likewise, the PKC inhibitor GF109203X (10 ?M) reversed the inhibition of aggregation and the increased cGMP levels in platelets of LPS-treated rats at 6h. We demonstrated that AKT phosphorylation at Thr308 was significantly higher in platelets of LPS-injected rats than in the saline group. The AKT inhibitor PPI-1 (20 ?M) increased platelet aggregation of rats 6h after LPS-injection to the levels comparable to the saline group, despite of the PI3K inhibitor wortmannin (100 nM) has had no effect. Platelet aggregation of rats 48h after LPS injection was not affected by any enzymatic inhibitors used in this work. Increased ROS formation in platelets of LPS injected rats at 6h or 48h was followed by a marked increase of the NADPH oxidase subunit p47-phox phosphorylation at Ser345. Incubation of platelets of LPS-injected rats with GF109203X inhibited the p47-phox phosphorylation as well as ROS generation. The increased ROS production in platelets of rats 6h after LPS-injection was reduced 42% by PP2. Inhibition of both PI3K and AKT did not change ROS production in platelets of LPS-injected rats. Incubation of either ODQ or Rp-8-Br (5 ?M) reduced significantly the ROS production just in platelets of rats 48h after LPS-injection. Therefore, our results show that the inhibition of ADP-induced platelet aggregation of rats 6h after LPS injection is mediated by NO/cGMP/PKG-dependent mechanisms, and PKC and AKT probably act upstream upregulating this pathway. On the other hand, the inhibitory effect of LPS at 48h on platelet aggregation is essentially dependent on ONOO- production. In addition, our results show that the augmented ROS production in platelets of LPS-treated rats is mediated by PKCdependent phosphorylation of p47-phox. Besides PKC, the increased ROS formation in platelets is also modulated by Src at 6h after LPS injection, while NO/cGMP/PKG pathway takes part of this effect at 48h
Subject: Plaquetas (Sangue)
Agregação plaquetária
NADPH oxidase
Sepse
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2013
Appears in Collections:FCM - Tese e Dissertação

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