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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Construção e caracterização fenotípica de cepas mutantes de Streptococcus mutans de genes relacionados à sua virulência = Construction and phenotypic characterization of Streptococcus mutans mutant strains of genes related to virulence
Title Alternative: Construction and phenotypic characterization of Streptococcus mutans mutant strains of genes related to virulence
Author: Galvão, Lívia Câmara de Carvalho, 1985-
Advisor: Rosalen, Pedro Luiz, 1960-
Abstract: Resumo: O fato de Streptococcus mutans conseguir emergir como microrganismo dominante no biofilme dental mesmo sob condições de estresse faz com que ele seja alvo de múltiplos interesses não apenas para a saúde oral, mas também para a saúde sistêmica. O sistema proteolítico Clp (Protease caseinolítica dependente de ATP) detém o papel central na tolerância desse microrganismo frente ao estresse ambiental, por desempenhar um importante papel na homeostase celular e controlar a estabilidade de proteínas reguladoras. Além disso, observou-se que a proteína Spx serve de substrato para esse sistema Clp e por isso foi feita uma detalhada caracterização fenotípica de Spx, regulador global, capaz de regular a transcrição de muitos genes conhecidamente relacionados ao estresse oxidativo em S. mutans e outros genes ainda hipotéticos. Assim, o objetivo deste trabalho foi construir e caracterizar fenotípicamente, in vitro e in vivo, cepas mutantes de S. mutans UA159 com deleção de genes hipotéticos, que apresentaram expressão alterada nas mutantes dos genes spxA1 e spxA1spxA2. Foram construídas as mutantes dos genes selecionados: smu143c smu144c, smu247, smu248, smu540, smu569, smu570, smu929, smu1296, smu1497 e smu1685, hipotéticos e regulados por Spx. Foi feita a análise transcricional dos genes selecionados frente ao estresse oxidativo através de PCR quantitativo (RT-qPCR). As mutantes construídas foram caracterizadas fenotipicamente por meio da avaliação da sua susceptibilidade, sobrevivência e crescimento sob condições de estresse ácido, oxidativo, em presença de ferro e outros metais. Em acréscimo, foi feita uma avaliação quanto à capacidade de formação de biofilme em meio com sacarose e esses genes foram avaliados por meio de ensaio de transcrição in vitro de forma a confirmar a sua regulação direta ou indereta por Spx . As cepas selecionadas por apresentarem fenótipo que justificasse relação com estresse oxidativo foram também investigadas quanto a capacidade de colonização em modelo animal sujeito a alto desafio cariogênico. Além disso, foi pesquisada a capacidade de cepas mutantes de Spx em causar lesões cariosas em ratos e seu papel regulatório como ativador de competência, na capacidade de formar mutacinas, biofilmes e glucanos a partir de sacarose. Além disso, a cepa mutante smu1784c, também regulada por Spx, foi submetida a uma caracterização inicial em busca de fenótipos que justifiquem sua relação com o gene eep de Enterococcus faecalis ou com estresse oxidativo em S. mutans. Com este trabalho, por meio de uma caracterização fenotípica detalhadas de novos genes regulados por Spx pôde-se relacioná-los ao estresse oxidativo em S. mutans, além de que verificou-se relação desses genes e de Spx com a homeostase de ferro. Pôde-se confirmar o papel de Spx na patogênese da doença cárie e virulência do S. mutans uma vez que as mutantes dos genes spxA1 e spxA2 reduziram a formação de cárie em modelo animal, mostraram-se menos competentes e spxA1 mostrou-se incapaz de produzir mutacinas. E o gene smu1784c, também regulado por Spx, mostrou-se envolvido com respostas ao estresse ácido e oxidativo e na virulência de S. mutans, uma vez que a cepa mutante mostrou-se atenuada em modelo de Galleria mellonella e capaz de reduzir os parâmetros bioquímicos relacionados à formação de biofilme. Portanto, esses achados confirmam e elucidam o papel regulador de Spx, possibilitando a identificação de novos alvos terepêuticos para a prevenção/tratamento de doenças envolvendo este microrganismo

Abstract: Streptococcus mutans is abble to emerge as dominant flora in biofilms even during stress conditions and has been studied in dentistry and medicine. The S. mutans Clp proteolytic system (Caseinolytic protease ATP-dependent) holds a central role in stress tolerance by controlling cellular homeostasis and stability of regulatory proteins. Besides, it was shown that Spx is substrate of Clp what justified a detailed phenotypic characterization of Spx, a global regulator able to regulate transcription of well-known genes related to oxidative stress and others hypothetical genes. Thus, the goal of this study was to construct and phenotypically characterize, in vitro and in vivo, S. mutans knockout mutants of hypothetical genes that showed altered expression in the ?spxA1 and ?spxA1/sxpA2 strains. The mutants of the following genes, regulated by Spx and strong candidates to be related with survival of S. mutans in stress conditions were constructed: smu143c smu144c, smu247, smu248, smu540, smu569, smu570, smu929, smu1296, smu1497 and smu1685. RT-qPCR was used to evaluate the responses of Spx-regulated genes during oxidative stress in the parental and ?spx strains. The mutant strains were characterized by evaluation of its susceptibility, survival and growth under oxidative and acid stresses conditions, as well as in presence of iron and other metals. In addition, their ability to form biofilm in presence of sucrose was evaluated. These genes were also assessed through in vitro transcription assay to confirm their direct regulation by Spx. Selected strains that showed phenotypes associated with oxidative stress management were also evaluated for their ability to colonize using an animal model subjected to high cariogenic challenges. Besides, Spx mutant strains were evaluated for their ability to cause dental caries using an animal model and their regulatory role as competency activator and mutacin, biofilm and glucan sinthesizer. Moreover, mutant for gene smu1784c, also regulated by Spx, was characterized to find phenotypes that justified its relation with eep in Enterococcus faecalis or with oxidative stress in S. mutans. The detailed phenotipic characterization of novel Spx regulated genes lead to their involvment with oxidative stress in S. mutans. Furthermore, these genes and Spx were associated with iron homeostoasis. The role of Spx in caries pathogenesis was confirmed once spxA1 and spxA2 genes were able to reduce caries score in an animal model. Also, smu1784c gene, regulated by Spx, showed involvement with acid and oxidative stresses responses, and virulence of S. mutans once the mutant strain of this gene showed attenuated behavior in Galleria mellonella model. The mutant ?smu1784c was also able to reduce biochemical parameters related with biofilm formation. Therefore, these findings support the regulatory role of Spx enabling the identification of new therapeutic targets usefull for prevention and treatment of S. mutans related diseases
Subject: Cárie dentária
Estresse oxidativo
Biofilme
Ativação transcricional
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:FOP - Tese e Dissertação

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