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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Atividade antiproliferativa in vitro da coronarina D
Title Alternative: In vitro antiproliferative activity of coronarin D
Author: Okubo, Márcia Yumi, 1990-
Advisor: Carvalho, João Ernesto, 1954-
Abstract: Resumo: Este estudo teve como objetivo avaliar a atividade antiproliferativa da coronarina D, em painel de células tumorais humanas composto por dez linhagens, através do método de sulforrodamina B. Entre essas linhagens, a de glioblastoma (U251) foi uma das que apresentou maior seletividade, e por isso foi selecionada para os estudos de morte celular e controle do ciclo celular utilizando citometria de fluxo. Após avaliação da viabilidade celular, na qual as células de U251 foram tratadas com diferentes tempos e concentrações, foram determinadas as condições de tratamento empregadas nas análises de citometria de fluxo. Foram escolhidas as concentrações não tóxicas de 2,5 µM; 5 µM e 10 µM e os tempos de 24 e 48 horas para quantificação do DNA nas fases G1, S e G2/M com iodeto de propídio, enquanto que na avaliação de morte celular envolvendo exposição de resíduos de fosfatidilserina (marcação pela anexina V-PE), foram selecionados os tempos de exposição de 12 e 24 horas, nas concentrações de 10, 20 e 40 µM de coronarina D (viabilidade celular de 70% a 80%). Em seguida, foram realizados os ensaios de: ativação de caspases utilizando o fluoróforo SR-VAD-FMK, perda de potencial de membrana mitocondrial indicada pela redução da fluorescência da rodamina 123 e liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2) dosada através da fluorescência de DCF. Os resultados indicaram que a coronarina D na concentração de 10 µM, alterou a cinética do ciclo celular com acúmulo na fase G1 após 24 e 48 horas de exposição. Além disso, foi observada a sinalização para processo de morte através da exposição da fosfatilserina nas concentrações testadas em 12 e 24 horas de tratamento. Nas concentrações de 20 e 40 µM, após 24 horas de tratamento houve ativação de caspases com redução do potencial de membrana mitocondrial observado em 6, 9 e 12 horas que foi ocasionada pela liberação da H2O2, uma espécie reativa de oxigênio, após 1 hora e 30 minutos de tratamento. Nesses testes foram utilizadas a análise de variância de duas vias (ANOVA), com nível de significância p<0,05. Adicionalmente, foi realizada uma avaliação preliminar de segurança do tratamento com a coronarina D através do teste de indução de micronúcleo na linhagem de ovário de hamster chinês (CHO-K1) nas condições de ausência e presença de enzimas de metabolização humana (fração S9). Sendo notada uma alta frequência de micronúcleo na concentração de 10 µM que foi reduzida na presença de enzimas de metabolização da fração S9. Esses resultados foram submetidos à análise de variância de uma única via (ANOVA), seguida de Teste de Tukey (p<0,05). Portanto, sugere-se que a coronarina D foi capaz de induzir a parada das células U251 no ponto de checagem entre a fase G1 e S, de conduzi-las à morte celular pelo mecanismo de apoptose intrínseca, iniciado por um estresse originado da liberação de H2O2 que conduz à redução do potencial de membrana mitocondrial e à ativação de caspases, e de interagir com o DNA causando maiores danos ao material genético sem a fração S9

Abstract: This study aimed to evaluate the antiproliferative activity of coronarin D in human tumor cell panel consisting of ten cell lines by the sulforhodamine B method. Among these cell lines, the glioblastoma (U251) was one that showed greater selectivity, and so it was selected for studies of cell death and cell cycle control using flow cytometry. After evaluation of cell viability, in which U251 cells were treated with different times and concentrations were determined by the treatment conditions applied in the analysis of flow cytometry. Non-toxic concentrations were selected, which are 2.5 µM; 5 µM and 10 µM and times of 24 and 48 hours for quantitation of DNA in phases G1, S and G2/M using propidium iodide, whereas the assessment of cell death involving exposure of phosphatidylserine residues (labeled by Annexin V- EP), the exposure times of 12 and 24 hours were selected at concentrations of 10, 20 and 40 µM of coronarin D (cell viability 70% to 80%). Then, tests were performed: activation of caspases using fluorophore SR-VAD-FMK, loss of mitochondrial membrane potential indicated by the reduction in fluorescence of rhodamine 123 and release of hydrogen peroxide (H2O2) measured by DCF fluorescence. The results indicated that coronarin D in the concentration of 10 µM, altered cell cycle kinetics with accumulation in the G1 phase after 24 and 48 hours of exposure. Furthermore, signaling was observed for death process through exposure phosphatidylserine in concentrations at 12 and 24 hours of treatment. At concentrations of 20 and 40 µM, after 24 hours of treatment there was caspase activation with a reduction of mitochondrial membrane potential observed in 6, 9 and 12 hours was caused by the release of H2O2, a reactive oxygen species, after 1 hour 30 minutes of treatment. These tests were used to two-way analysis of variance (ANOVA) with significance level of p <0.05. In addition, a preliminary assessment of treatment safety with coronarin D through the micronucleus induction test in cell line of Chinese hamster ovarian (CHO-K1) were evaluated in the absence and presence of enzymes of human metabolism (S9 fraction). A high frequency of micronucleus in the concentration of 10 µM which was reduced in the presence of metabolizing enzymes S9. These results were submitted to analysis of variance of a single (ANOVA) followed by Tukey test (p <0.05). Therefore, it is suggested that the coronarin D was able to induce the arrest of the U251 cells in the checkpoint between G1 and S phase, to lead them to cell death by intrinsic mechanism of apoptosis initiated by a originated stress release H2O2 leads to a reduction of mitochondrial membrane potential and caspase activation, and interact with DNA causing further damage to the genetic material without S9 fraction
Subject: Ensaios de seleção de medicamentos antitumorais
Glioblastoma
Citometria de fluxo
Apoptose
Ciclo celular
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2016
Appears in Collections:FOP - Tese e Dissertação

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