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Type: TESE
Title: Analise de metilação no promotor dos genes IL8, TLR2 e TLR4 em celulas epiteliais da mucosa bucal e celulas do tecido gengival de individuos fumantes e não fumantes com periodontite cronica
Title Alternative: DNA methylation analysis of the IL8, TLR2 and TLR4 gene promoters in oral mucosa cells and gingival tissue of smokers and non-smokers subjects with chronic periodontitis
Author: Oliveira, Naila Francis Paulo de
Advisor: Pardo, Ana Paula de Souza, 1975-
Abstract: Resumo: A doença periodontal crônica é caracterizada pela inflamação e destruição dos tecidos periodontais, podendo levar à perda dos dentes. Está claro que a periodontite é influenciada pela genética do hospedeiro, constituição do biofilme bucal e o hábito de fumar. Sabe-se que a interleucina 8 (IL-8) é a principal molécula atrativa de neutrófilos. Essas células são as primeiras a chegar aos locais inflamados e além de realizar fagocitose, participam também da destruição do tecido periodontal. Sabe-se também que os patógenos que causam a periodontite são reconhecidos por proteínas receptoras de membrana denominadas receptores Toll-like (TLR), que uma vez acionados iniciam a resposta imune inata. IL8 e TLRs são expressos constitutivamente por células bucais e estão superexpressos na periodontite. Em particular, a IL-8 está ainda aumentada em indivíduos com periodontite crônica fumantes. A expressão gênica é controlada por diferentes mecanismos, incluindo a metilação de DNA. A metilação em dinucleotídeos CpG presentes em promotores de genes inibe a expressão do gene, podendo silenciar por completo a expressão gênica. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar o padrão de metilação no DNA nas regiões promotoras dos genes IL8, TLR2 e TLR4 em células bucais e sanguíneas de indivíduos com periodontite crônica fumantes e não fumantes. Também, analisar os níveis de transcritos destes genes quando encontrado diferença no padrão de metilação entre os grupos, a fim de associar o padrão de metilação com a transcrição gênica. Amostras de DNA foram purificadas de células da mucosa bucal, de tecido gengival e tecido sanguíneo de indivíduos saudáveis e com periodontite crônica fumantes e não fumantes. A metilação no gene IL8 foi investigada pela transformação com bissulfito de sódio seguida pela técnica de PCR Específica para Metilação. A análise de metilação nos genes TLR2 e TLR4 foi realizada utilizando o método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação. Após o tratamento pelo bissulfito de sódio (IL8) ou digestão enzimática (TLRs), DNA foi amplificado por PCR, submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida 10% corado pelo SYBR Gold. Os níveis de transcritos foram analisados utilizando PCR Quantitativo. A análise estatística foi realizada pelo teste de x2 e Kruskal-Wallis para metilação e expressão gênica, respectivamente. A correlação entre metilação versus expressão foi realizada a partir do teste de coeficiente não linear de Spearman. Os resultados indicam que para células epiteliais da mucosa bucal, a frequência de desmetilação no gene da IL8 é maior no grupo periodontite crônica, independente do hábito de fumar, em comparação ao grupo saudável (p<0,0001). Não foram detectadas diferenças no padrão de metilação no tecido gengival e sanguíneo entre os grupos. Foram encontrados maiores níveis de transcritos de IL-8 no grupo periodontite em comparação ao grupo saudável (p=0,007), entretanto, não há relação entre o padrão de metilação e expressão gênica (p>0,05). Para o gene TLR2, não foram detectadas diferenças no padrão de metilação entre os grupos em nenhum tecido estudado (p>0,05). Para o gene TLR4, foi encontrada massiva desmetilação na mucosa bucal e para tecido gengival a desmetilação foi ainda maior, principalmente dentro do grupo periodontite (p=0,03).

Abstract: Chronic periodontal disease is characterized by inflammation and destruction of periodontal tissues, culminating in teeth loss. It is clear that periodontitis is influenced by host genetic, biofilm, and smoking habit. There are some important molecules involved on the pathogenesis of periodontitis. Interleukin (IL-8) is responsible for inducing chemotaxis, which is the directed migration of neutrophil to a site of inflammation. Neutrophil contributes to the elimination of the infecting bacteria and tissue destruction. Infecting bacteria are recognized by transmembrane receptors called Toll-like receptors (TLR), which recognized molecular pattern of microorganisms. The recognition of a variety of microorganisms components by individual TLRs induces innate immune responses. IL8 and TLRs are constitutively expressed by buccal cells and they are upregulated during periodontitis. Genetic transcription is regulated by different pathways, including DNA methylation. Methylation in CpG dinucleotides of gene promoters downregulates the levels of transcription and may even silence the gene transcription completely. So, the objective of this study was to analyze the pattern of DNA methylation in the promoter region of IL8, TLR2 and TLR4 genes in oral cells and blood tissue from healthy subjects and subjects with chronic periodontitis smokers and non-smokers. We also investigated the levels of mRNA expressed when different methylation status were found amoung groups. DNA samples were purified from buccal mucosa, gingival tissue and blood tissue of healthy subjects and subjects with chronic periodontitis smokers and non-smokers. Methylation of IL8 gene was investigated using sodium bisulphite modification followed by Methylation Specific PCR. Methylation analysis of TLRs genes were performed using Specific Methylation-Sensitive Restriction Enzymes. After sodium bisulphate modification (IL8) or enzymatic digestion (TLR2 and TLR4), DNA was amplified by PCR and the results were visualized after electrophoresis on 10% polyacrylamide gels stained by SYBR Gold. Levels of mRNA were analised using Real Time PCR. The statistical analysis was performed using the test of x2 and Kruskal-Wallis test for methylation status and gene expression, respectively. The correlation among methylation status versus gene expression was performed using no linear coefficient test of Spearman. The results indicate that frequency of IL8 gene demethylation is higher in individuals with chronic periodontitis, independent of smoking habit, than healthy group (p<0.0001). Differences were not detected in the methylation status in gingival tissue and blood tissue among the groups. Higher levels of IL-8 mRNA are expressed in periodontitis group than healthy group (p=0.007), however, we did not observe a relationship between IL8 gene methylation and gene expression. No significant difference was observed for TLR2 gene promoter among groups in all studied tissues (p>0.05). TLR4 gene promoter showed massive demethylation in oral mucosa and for gingival tissue it was even higher, mainly in periodontitis group (p=0.03).
Subject: Interleucinas
Reação em cadeia da polimerase
RNA
Tabaco
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2009
Appears in Collections:FOP - Tese e Dissertação

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