Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/267497
Type: TESE
Title: Purificação de pro-insulina humana recombinante com cauda de poli(histidina) : cromatografia em membranas de afinidade com ions metalicos imobilizados
Author: Aquino, Luciana Cristina Lins de
Advisor: Bueno, Sônia Maria Alves, 1961-
Bueno, Sonia Maria Alves
Abstract: Resumo: A cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados (IMAC) tem sido uma técnica bastante utilizada para a purificação de proteínas recombinantes que possuem uma cauda de polihistidina acoplada na porção N ou C-terminal. Como alternativa aos géis de agarose (tradicionalmente empregados em IMAC) tem sido proposto o emprego de membranas, cuja vantagem principal é a transferência de massa ser governada principalmente por convecção. Este trabalho investigou o potencial de membranas de fibras ocas de álcool poli( etileno )vinílico (pEV A) com íons metálicos imobilizados para a purificação de pró-insulina recombinante com cauda de poli(histidina) (PIS) a partir de soluções não clarificada (PIS-NC) (obtida após solubilização dos corpos de inclusão e sulfitólise) e clarificada (PIS-C) (obtida após a centrifugação da solução não clarificada). Com este objetivo, experimentos de adsorção foram realizados com fibras finamente cortadas e em módulo de filtração. Inicialmente as membranas de PEV A cortadas foram ativadas e o agente quelante ácido iminodiacético (IDA) foi imobilizado, sendo estas membranas modificadas denominadas PEV A-IDA. A seguir, dentre as membranas PEV AIDA-Me2+ (Me2+ equivalente aos íons CU2+, Ni2+, Zn2+ ou Co2+), PEV A-IDA-Ni2+ e PEV AIDA-CU2+ foram as que apresentaram melhor eficiência para adsorção de pró-insulina (90 e 97% do total de proteína alimentada, respectivamente), sendo então selecionadas para a purificação de PIS a partir das soluções PIS-NC e PIS-C. As membranas PEV A-IDA-Ni2+ apresentaram melhor seletividade e capacidade de adsorção de PIS a partir de PIS-C e PISNC (29 e 26% de PIS adsorvida, respectivamente) do que as membranas PEV A-IDA-Cu2+ (7 e 0% de PIS adsorvida, respectivamente), sendo este adsorvente selecionado para a continuação do trabalho. A adsorção de PIS nas membranas cortadas foi avaliada através da cinética e isoterma de adsorção utilizando, respectivamente, a expressão da taxa de variação da concentração de proteína na fase líquida com o tempo e o modelo de Langmuir. A seguir, foi construído, um módulo de filtração, no qual as membranas foram ativadas e IDA foi imobilizado (protocolos equivalentes aos utilizados para as fibras cortadas). Através de experimentos de filtração, determinou-se curvas de ruptura e a capacidade dinâmica para a adsorção de PIS a partir das soluções PIS-NC e PIS-C. As capacidades de adsorção de próinsulina das fibras cortadas, módulo de filtração e gel foram comparadas. As membranas PEV A-IDA-Ni2+ cortadas e o módulo de filtração apresentaram menor capacidade de adsorção de PIS (4,0 e 4,62 mg/g seca, respectivamente) do que o gel Sepharose-IDA-Ni2+ (12,26 mg/g seco). Visando melhorar o desempenho das membranas de PEV A, estas foram ativadas e um método de polimerização foi utilizado para a imobilização do ligante ácido vinilbenziliminodiacético (VBIDA) nas membranas, sendo após este procedimento, denominadas PEV A-VBIDA As membranas PEV A-VBIDA-Ni2+, apesar de maior densidade de ligantes (148 J.1II1o1 de Ni2+/g seca), demonstraram capacidades de adsorção de PIS de 2,4 e 8,0 vezes menores, quai:1do alimentadas com, respectivamente, soluções PIS-C e PIS-NC, do que PEV A-IDA-Ni2+ (37 !lmol de Ne+/g seca). Contudo, apesar das membranas terem apresentado menor capacidade de adsorção de PIS em relação ao gel, a possibilidade de processar soluções contendo material particulado sem a necessidade de prévia clarificação, tomam este suporte vantajoso para a purificação de proteínas

Abstract: The Immobilized metal ion affinity ehromatography (IMAC) is a teehnique that has been used for the purifieation of reeombinant proteins that have a polyhistidine tag eoupled at the N or C-terminal portion. The use of membranes has been proposed as an altemative to the agarose gels traditionally employed in IMAC. The main advantange of membranes systems is that the mass transfer is mainly govemed by conveetion. In this work, we investigated the potential ofpoly(ethylene) vinyl aleohol (pEV A) hollow fibers membranes eontaining immobilized metal ions for the purifieation of reeombinant His-tag human proinsulin (PIS) from non-clarified (PIS-NC) (obtained afier inc1usion body solubilization and sulfonation reaetion) and clarified (PIS-C) (obtained afier eentrifugation of non clarified solution) solutions. Adsorption experiments were earried out using fixed bed (finelly eut fibers) eomposed of eolumn and filtration module. In the first part ofthis work, fixed bed experiments aimed to seleet a metal ion of high effieieney in adsorbing the proinsulin in terms of eapaeity, selectivity and kineties. Initially, finely eut PEV A hollow fiber membranes were aetivated and then iminodíaeetie aeid (IDA) was immobilized on them. These modífied membranes were named PEV A-IDA Then, among PEV A-IDA-Me2+ membranes (pEV A-IDA onto whieh different metal íons - CU2+, Ni2+, Zn2+ or C02+- were immobilized), PEV A-IDA-Ni2+ and PEV A-IDA-CU2+ showed higher effieieney for proinsulin adsorption (90 and 97% of total fed protein, respectively), and they were seleeted for PIS purification from PIS-NC and PIS-C solutions. The PEV A-IDA-Ni2+ membranes presented better PIS seleetivity and adsorption capaeity for the PIS-C and PISNC solutions (29 and 26% ofPIS adsorbed, respectively) than PEV A-IDA-CU2+ (7 and 0% ofPIS adsorbed, respeetively). In the seeond part ofthis work a filtration module was built, and their membranes were aetivated and IDA and the Ni2+ íon were immobílized using similar protoeols used for eut membranes. The breakthrough curves and the dynamie eapaeity of this module for the PIS adsorption from PIS-NC and PIS-C solutions were determined. The PIS adsorption eapaeities using eut fibers, filtration module and Sepharose-IDA-Ni2+ were compared. The PEV A-IDA-Ni2+ finely eut membranes and the filtration module presented lower adsorption eapaeity (4.00 and 4.62 mg/g dry, respectively) than Sepharose-IDA-Ni2+ (12.26 mg/g dry). Aimíng to improve the perfonnance of PEV A membranes, they were activated and the iminodiacetic vinylbenzyl acid (VBIDA) was immobilized to them. After this procedure the membranes were named PEV A-VBIDA. The PEV A-VBIDA-Ni2+ membranes, in spite of the high ligand density (148 _mol of Ni2+/g dry), demonstrated lower adsorption capacities for proinsulin when PIS-C and PIS-NC solutions were used as feed (2.4 and 8.0-fold, respectively) than those obtained in PEV A-IDA-Ni2+ (37 _mol of Ni2+/g dry). However, even through PEV A membranes presented a lower PIS adsorption capacity than Sepharose gel, the possibility of processing solutions containing particulate material without prior clarification, makes this support advantageous for protein purification
Subject: Proteínas - Purificação
Insulina
Cromatografia líquida
Membranas (Tecnologia)
Adsorção
Íons metálicos
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2004
Appears in Collections:FEQ - Tese e Dissertação

Files in This Item:
File SizeFormat 
Aquino_LucianaCristinaLinsde_D.pdf4.72 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.