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Type: TESE
Title: Cristalização de proteinas : monitoramento in situ de supersaturação atraves de espectroscopias ATR-FTER e Raman
Author: Tamagawa, Rosana Emi
Advisor: Miranda, Everson Alves, 1959-
Abstract: Resumo: Neste trabalho as espectroscopias ATR-FTIR ("Attenuated Total Reflectance - Fourier Transform Infrared Radiation") e Raman foram utilizadas no monitoramento e controle de supersaturação de proteínas. Nos estudos utilizando A TR-FTIR foi desenvolvida uma célula para cristalização por difusão de vapor adaptada a um elemento de reflectância interna ATR de germânio (Ge), possibilitando assim o monitoramento in situ nesse sistema. O monitoramento da concentração de soluções de lisozima no interior dessa célula se baseou em um modelo de calibração PLS ("Partial Least Squares") construído a partir de espectros de soluções com concentrações conhecidas dessa proteína. Esse aparato foi aplicado com sucesso na concentração lenta e gradual de soluções de lisozima e o monitoramento da concentração protéica ao longo do tempo se mostrou bastante preciso. Na presença de cristais, entretanto, houve influência dos mesmos sobre o monitoramento da solução, causado pela decantação e suposta interação dos cristais com a superfície do elemento de Ge. Embora não tenha ocorrido adsorção protéica a partir da solução no elemento A TR, a disposição das moléculas no hábito cristalino parece favorecer a adsorção dos cristais de proteína no Ge. Além desse sistema, foi avaliada uma sonda A TR de sele neto de zinco (ZnSe) que apresentou a vantagem de não sofrer influência significativa da temperatura na predição de concentrações de lisozima, gerando a possibilidade de ser aplicada no controle da supersaturação por temperatura. Essa sonda, entretanto, apresentou deficiência no monitoramento ao longo do tempo, de soluções de lisozima e tripsina, devido à provável adsorção protéica no elemento ATR. A espectroscopia AT -FTIR foi assim inadequada para o monitoramento de supersaturação nas condições estudadas. A espectroscopia Raman, apesar de não ser tradicionalmente utilizada para quantificações, permitiu o monitoramento in sftu da supersaturação com relativa precisão. Um modelo de calibração PLS desenvolvido a partir de soluções padrão de aprotinina e (NH4):zSO4 possibilitou medidas simultâneas de suas concentrações durante cristalizações em gota suspensa ("hanging-drop"). Através dessa possibilidade determinou-se a solubilidade de aprotinina na presença de NaCI e (NH4hSO4 a partir de gotas de 10 _l de solução e demonstrou-se o controle da supersaturação propiciando aumento do tamanho dos cristais de aprotinina em cerca de três vezes em relação à cristalização sem controle de supersaturação. O monitoramento simultâneo da concentração de proteína e sal, trouxe evidências da co-cristalização de aprotinina e (NH4)2S04, isto é, de que ambas as moléculas participaram na formação dos cristais. Dessa forma, apesar do potencial da espectroscopia infravermelho, verificou-se a superioridade da metodologia de monitoramento baseado na espectroscopia Raman. Uma das principais vantagens desse segundo método foi a aplicação da sonda de fibra óptica que permitiu medidas remotas e de modo não invasivo, tendo em vista que a interação de proteínas com diferentes materiais pode ser um problema crítico no monitoramento in situ de suas soluções

Abstract: In this study, Raman and ATR-FTIR (Attenuated Total Reflectance - Fourier Transform Infrared Radiation) spectroscopies were employed for the in situ monitoring and control of protein supersaturation. A germanium (Ge) ATR accessory adapted to a vapour diffusion crystallization cell allowed the ín situ monitoring of solutions inside this cell. The monitoring of Iysozyme concentrations was based on a PLS (Partial Least Squares) calibration of spectra trom solutions with known concentrations of this protein. This apparatus was successfully apllied for the gradual increasing of Iysozyme concentration, which was monitored over time with good accuracy. H oweve r, when this system was used to monitor the liquid phase in the presence of crystals, the prediction was affected by a hypothetical interaction between Iysozyme crystals and Ge surface. Although any interaction of protein from liquid phase and the A TR element was observed, it seems that some features of the crystal surface favoured its adsorption onto the Ge element. Besides the Ge based system, a zinc selenide (ZnSe) immersion probe was also evaluated for the monitoring purpose. Lysozyme concentrations measured with this probe were demonstrated to not being significantly affected by temperature, meaning that it could be applied for the supersaturation control by temperature. This probe, however, was not adequate for the monitoring of Iysozyme and trypsin solutions over time, due to the protein adsorption onto the A TR element. Therefore, the A TR-FTIR methods were not suitable for the measuring of supersaturation in the studied conditions. In spite of not being traditionally applied as a reliable quantification technique, Raman spectroscopy allowed the ín situ measurement of aprotinin and (NH4)2S04 concentrations with reasonable precision. A PLS calibration model, based on spectra of aprotinin and (NH4)_O4 solutions with known concentrations allowed the simultaneous monitoring of these species during hanging drop crystallizations. This calibration model was employed in the determination of aprotinin solubility in the presence of NaCI and (NH4hSO4 carried out in the hanging drop mode using 10 _I drops. Monitoring of the drop compositional change over time allowed the control of supersaturation, accomplished by vapourdiffusion control, leading to an increase of crystal size three fold when compared to crystals obtained without supersaturation control. The observed decrease of protein and salt concentrations during the growth process was an indicative of the co-crystallization of aprotinin and (NH4)2S04: both molecules were taken into the crystal structure. Therefore, despite the potential of ATR-FTIR spectroscopy, Raman technique was considered superior for the present purpose. Certainly the non-invasive nature of Raman data collection should be pointed out as its main advantage over A TR-FTIR technique, considering that the sticky nature of proteins can be a critica I problem for immersion probes
Subject: Cristalização
Espectroscopia de infravermelho
Espectroscopia Raman
Proteínas - Separação
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2003
Appears in Collections:FEQ - Dissertação e Tese

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