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Type: TESE
Title: Cromatografia negativa em Sepharose-TREN como tecnica de purificação de proteinas adicionadas artificialmente a extrato de soja
Title Alternative: Negative chromatography on Sepharose-TREN as a technique of proteins purification artificially added to soybean extract
Author: Bresolin, Iara Rocha Antunes Pereira
Advisor: Bueno, Sônia Maria Alves, 1961-
Bueno, Sonia Maria Alves
Abstract: Resumo: Nos últimos tempos têm-se estudado plantas como biorreatores para a produção de proteínas recombinantes de interesse industrial e farmacêutico. Quando comparadas a outros sistemas de expressão, as plantas apresentam algumas vantagens, como a realização de modificações pós traducionais, baixo custo de produção, baixos riscos de contaminação por patógenos humanos, possibilidade das proteínas serem acumuladas em órgãos específicos que podem gerar maior estabilidade das mesmas. Visando a obtenção de conhecimento de base para posterior aplicação na purificação de proteínas recombinantes produzidas em plantas transgênicas, realizaram-se estudos de purificação por cromatografia negativa em Sepharose-TREN de proteínas contendo ampla faixa de pI (IgG humana), pI ácidos (HSA e BSA) e pI alcalinos (aprotinina e lisozima), adicionadas artificialmente ("spiking") a extrato de soja. Na cromatografia negativa, a proteína alvo é recuperada na fração não retida, enquanto as proteínas do extrato de soja permanecem adsorvidas na matriz. Visando maximizar a adsorção de proteínas do extrato de soja, avaliaram-se diferentes sistemas tamponantes, sendo que 2,8% das proteínas alimentadas foram detectadas na etapa de lavagem, quando se utilizou MES 25 mmol/L pH 6,5. Adicionandose IgG humana na forma de "spiking" ao extrato de soja na concentração de 1,0 mg/mL, recuperou-se 38% na lavagem com pureza de 86% e fator de purificação de 4,6. Por meio de experimentos de curva de ruptura, determinou-se a capacidade dinâmica de Sepharose- TREN como sendo 25,4 mg/mL de gel a uma vazão de 0,5 mL/min. Para proteínas de valores de pI ácidos, houve adsorção total das proteínas alimentadas enquanto que proteínas de pI alcalinos foram parcialmente adsorvidas, indicando que as interações que predominam entre o adsorvente Sepharose-TREN e proteínas são de natureza eletrostática. Para efeitos de comparação foram realizados experimentos de IMAC com íons Ni(II) e Cu(II) imobilizados em Sepharose-TREN alimentando-se extrato de soja com "spiking" de IgG humana. Resultados mostraram que a IgG apresentou pureza similar, porém com menor recuperação que em cromatografia negativa em Sepharose-TREN. Experimentos em Sepharose-DEAE foram realizados alimentando-se extrato de soja com "spiking" de IgG humana, possibilitando a adsorção de proteínas do extrato de soja e a purificação de IgG, porém com menor recuperação de IgG na lavagem quando comparado a Sepharose-TREN.

Abstract: In recent years, plants have been studied as bioreactors for the production of recombinant proteins with industrial and pharmaceutical interest. When compared to other expression systems, plants have several advantages, such as the possibility of posttranlationals modification, low production cost, low risk of contamination by human pathogens, and the accumulation of proteins in specific organs that can generate greater protein stability. Bioseparation is a key step in the bioprocessing of plant material used as biorreactors and chromatography a key unit operation in the bioseparation train. Negative chromatography - a chromatography in which the target protein is recovered in the nonretained fractions while impurities remain adsorbed in the matrix - allows product recovery in one step. Aiming to obtain the basic knowledge for further application in the purification of recombinant proteins produced in transgenic plants, in this work we evaluated the use of negative chromatography on Sepharose-TREN with spiking of proteins of wide pI range (human IgG), high pI (HSA and BSA) and low pI (aprotinin and lysozyme) added in soybean extract. Experiments using MES 25 mmol/L pH 6.5 as adsorption buffer, 2.8% of the total protein fed was found in flowthrough fractions. Adding 1.0 mg/mL of human IgG in soybean extracts, 38% of total protein was recovered in the washing step with 86% purity and purification factor of 4.6. Breakthrough curves showed that Sepharose-TREN presented a dynamic capacity of 25.4 mg of total protein per milliliter of gel at a flow rate of 0.5 mL/min. Total protein adsorption was achieved when proteins of low pI were used while proteins of high pI were partially adsorbed, showing that the interactions between the adsorbent and TREN-Sepharose proteins are electrostatic. Sepharose-TREN was used as chelating ligand in IMAC with immobilized Ni(II) and Cu(II). Experiments with soybean extract spiked with IgG as feedstream solution resulted in similar purity but a lower IgG recovery than those with Sepharose-TREN in negative chromatography. Classic ion exchanger Sepharose-DEAE adsorbed the native soybean proteins while IgG was recovered in nonretained fractions with similar purity but lower recovery than when using Sepharose-TREN.
Subject: Soja
Análise cromatográfica
Purificação
Aminas
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2009
Appears in Collections:FEQ - Tese e Dissertação

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