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Type: TESE
Title: Pre-purificação por eletrocoagulação de proteina sGFP produzida em folhas de Nicotiana benthamiana transgenica
Title Alternative: Pre-purification of recombinant sGFP produced in Nicotiana benthamiana leaves by electrocoagulation
Author: Robic, Goran
Advisor: Miranda, Everson Alves, 1959-
Abstract: Resumo: A técnica de eletrocoagulação tem sido usada basicamente em tratamento de água potável e águas residuais. Neste trabalho propusemos o uso desta técnica na recuperação e purificação (RPB) de proteínas recombinantes produzidas em plantas geneticamente modificadas. O desafio principal da RPB de uso de plantas como biorreatores é a presença de clorofila e polifenóis nos seus extratos, que causam precipitação e desnaturação das proteínas de interesse, além de danificarem membranas e géis de separação. Portanto, a remoção destes compostos é essencial. No presente trabalho estudou-se a aplicação de eletrocoagulação para clarificar extratos de folhas de Nicotiana benthamiana transgênica removendo a clorofila e polifenóis, sem remover a proteína recombinante sGFP (proteína verde fluorescente sintética). Primeiramente foi necessário desenvolver um método de determinação e quantificação de sGFP baseado na fluorescência intrínseca desta proteína. Os problemas com a fluorescência de fundo presente nos extratos de folhas de N. benthamiana e o aumento de intensidade da fluorescência da sGFP nestes extratos - provavelmente o resultado de dimerização de moléculas de sGFP promovida por composto(s) do extrato - por nós observados, tinham que ser resolvidos. Diluição de 20 vezes dos extratos contendo sGFP com solução de uréia 6 mol/L em fosfato de sódio 50 mmol/L pH 7,00 eliminou completamente estas duas interferências. Os estudos da eletrocoagulação foram iniciados desenvolvendo-se dois modelos de remoção de compostos biológicos de soluções aquosas por esta técnica. Os modelos desenvolvidos são baseados na formação de complexos entre o composto e o gel de hidróxido de alumínio ou a partição do composto entre a fase aquosa e fase do gel de hidróxido de alumínio. Análises teóricas e experimentais revelaram que os parâmetros relevantes na remoção destes compostos são a corrente utilizada - que afeta a taxa de formação de hidróxido de alumínio - e o pH da eletrocoagulação - que afeta a carga tanto do gel formado como dos compostos a serem removidos. Gel de hidróxido de alumínio produzido a pH 8,0 apresentou alta eficiência em remover clorofila e polifenóis dos extratos de folhas de N. benthamiana não-transgênica, ao passo que somente uma pequena porção de proteínas nativas foi removida. Portanto, o gel de hidróxido de alumínio produzido nesta condição foi adicionado a extratos de N. benthamiana transgênica contendo sGFP. A remoção de 99,7% clorofila, de 88,5% dos polifenóis e de 38,4% de proteína total do extrato foi observada sem remoção da sGFP (fator de purificação de 1,6). Portanto, a eletrocoagulação pode também ser usada como técnica de pré-purificação de proteínas recombinantes e ao mesmo tempo como método de clarificação de extratos de folhas.

Abstract: Electrocoagulation is a technique that has been basically applied to water and wastewater treatment. We propose here the extension of this relatively cheap technique to the field of downstream processing (DSP) of plant-derived proteins, in which plants are used as a bioreactor for recombinant protein production. The main problem in the DSP of this plant-based technology is the presence of chlorophyll and phenolic compounds in plant extracts, which tend to precipitate and denature the proteins besides damaging separation membranes and gels. Therefore their removal from the extracts is essential. In the present work we studied the application of a electrocoagulation based technique as a prepurification technique to clarify transgenic Nicotiana benthamiana leaf extracts by removing chlorophyll and phenolic compounds without removing the recombinant protein sGFP (synthetic green fluorescent protein). First, a method for fluorescence-based quantification of sGFP had to be developed. The background fluorescence of plant extracts and the increased level of sGFP fluorescence in N. benthamiana leaves extracts - probably the result of dimerization of sGFP molecules promoted by interaction with some component(s) of tobacco extract - observed by us had to be overcome. Diluting the tobacco extract spiked with sGFP by 20 times with 6 mol/L urea solution in 50 mmol/L sodium phosphate buffer pH 7.00 completely eliminated the two mentioned interferences. The electrocoagulation studies started with the development of simple timedependent models for electrocoagulation of biological compounds from solutions. These models are based on either stoichiometric complex formation between aluminium hydroxide gel and the compound or the partition of the compound between the aqueous and the aluminium hydroxide gel phase. Theoretical and experimental analysis demonstrated that a relevant parameters in the process of electrocoagulation of biological materials are the current applied - since it affects the rate of aluminium hydroxide formation - and the pH of electrocoagulation - since it affects the charges of the aluminium hydroxide gel formed and the components to be removed. Aluminium hydroxide gel produced at pH 8.0 demonstrated a high efficiency of clorophyll and phenolic compounds removal from non-transgenic N. benthamiana leafs extracts, while removing only relative small portion of the native proteins. Therefore, the aluminum hydroxide gel produced at this pH was added to transgenic N. benthamiana leaf extracts containing recombinant sGFP. Removal of 99.7% of chlorophyll and 88.5% of phenolic compounds were observed. Also at this conditions 38.4% of total protein was removed, which resulted in a purification factor of 1.6 with 100% of the sGFP recovered. Therefore the method proposed could also be used as a strategy of pre-purification of recombinant proteins besides at the same time clarifying the tobacco leaf extracts.
Subject: Plantas - Proteinas
Proteínas - Análise
Fumo
Purificação
Eletroquímica
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2009
Appears in Collections:FEQ - Dissertação e Tese

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