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Type: TESE
Title: Separação de fragmentos Fab humano por cromatografia negativa em poliaminas 'ômega'-aminohexil e poli(etilenoimina) imobilizadas em gel de agarose
Title Alternative: Separation of human Fab fragments by negative chromatography on polyamines 'ômega'-aminohexyl and poly(ethyleneimine) immobilized in agarose gel
Author: Carmignotto, Gabriela Pannunzio, 1987-
Advisor: Bueno, Sônia Maria Alves, 1961-
Bueno, Sonia Maria Alves
Abstract: Resumo: Os fragmentos Fab de imunoglobulina G são utilizados principalmente em testes diagnósticos e terapias. Por apresentarem tamanho reduzido, os fragmentos Fab possuem maior facilidade de penetração em tecidos e maior velocidade de circulação no plasma quando comparados à IgG intacta. A purificação dos fragmentos Fab é realizada geralmente por cromatografia de afinidade utilizando os ligantes bioespecíficos proteína A, proteína G e proteína L. Entretanto, esses ligantes apresentam algumas desvantagens, entre elas seu elevado custo e a necessidade de eluição em condições drásticas. Como alternativa, muitos estudos têm sido realizados empregando ligantes pseudobioespecíficos e de interação mista visando o desenvolvimento de novas estratégias que proporcionem a purificação dos fragmentos Fab. Neste contexto, este trabalho tem por objetivo avaliar a seletividade das poliaminas ?-aminohexil e poli(etilenoimina) imobilizadas em gel de agarose na separação de fragmentos Fab humano a partir de uma solução de IgG humana clivada enzimaticamente, empregando diferentes sistemas tamponantes. A recuperação seletiva dos fragmentos Fab foi avaliada por eletroforese SDS-PAGE, Western blot e imunodifusão radial. Os resultados indicaram que nas cromatografias realizadas em gel ?-aminohexil-agarose em Tris-HCl a pH 8,0, os fragmentos Fab foram recuperados nas frações não retidas, com valores calculados de pureza de 97% e recuperação de 100%. Nas cromatografias realizadas em gel PEI-agarose empregando o tampão Tris-HCl nos valores de pH de 7,5 e 8,0, a pureza obtida foi de 96% e a recuperação foi de 94% e 93%, respectivamente. As curvas de ruptura para os adsorventes foram determinadas e os resultados obtidos indicaram melhor recuperação do fragmento Fab com alta pureza no flowthrough para o ligante ?-aminohexil (2,7 mg) quando comparado ao ligante PEI (0,8 mg). A isoterma de adsorção de fragmentos Fc para o adsorvente ?-aminohexil-agarose foi determinada e os parâmetros capacidade de adsorção de 44,32 mg.mL-1 de gel e constante de dissociação de 1,11.10-5 mol.L-1 foram obtidos por ajuste destes parâmetros segundo o modelo de Langmuir-Freundlich. O valor de n obtido foi igual a 1,68, indicando cooperatividade positiva na adsorção dos fragmentos Fc e IgG não clivada. Os resultados mostraram que as poliaminas ?-aminohexil e PEI apresentaram potencial como ligantes para a purificação de fragmentos Fab

Abstract: Fab fragments from immunoglobulin G are considered an important tool for the therapy and diagnose of diseases. Their reduced molecular size is an advantage over the intact IgG allowing faster tissue penetration and circulation in the plasm. Fab fragments are often purified by affinity chromatography using biospecifics ligands, such as protein A, protein G, and protein L. However, the use of those ligands is hindered by their high costs and elution in drastic conditions. Several studies have been performed for the development of new techniques to improve the chromatographic purification of Fab fragment, e.g., using pseudobiospecifics or mix-mode ligands. In this context, we have evaluated the efficiencies of polyamines ?-aminohexyl and poly(ethyleneimine) (PEI) ligands immobilized in agarose gel aiming the purification of human Fab fragments. Our chromatographic studies were conducted feeding cleaved human IgG solution into the aforementioned adsorbents using different adsorption buffers and conditions. The selectivity towards Fab fragments was evaluated using SDS-PAGE, Western blot, and radial immunodiffusion. The chromatography performed with ?-aminohexyl-agarose using Tris-HCl buffer pH 8.0 recovered 100% of the Fab fragments with 97% of purity. Studies done with adsorbent PEI-agarose using Tris-HCl pH 7.5 and 8.0 as adsorption buffers recovered 94% and 93% of Fab fragments, respectively, with 97% of purity. Breakthrough curves experiments showed that the ?-aminohexyl ligand was superior than PEI ligand in terms of recovering Fab fragment with high purity in flowthrough (2.7 mg against 0.8 mg, respectively). The adsorption isotherm of ?-aminohexil-agarose adsorbent was determined adjusted by the Langmuir-Freundlich model as well (Qm: 44.32 mg.mL-1 of gel; Kd: 1.11.10-5 mol.L-1). Additionally, Fc fragments and IgG binding showed positive cooperativity (n=1.68). All these results indicate that ?-aminohexyl and PEI polyamines are potential ligands for the purification of Fab fragments and can possibly improve the existing techniques employed for this purpose
Subject: Imunoglobulina G
Purificação
Cromatografia
Poliaminas
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2015
Appears in Collections:FEQ - Dissertação e Tese

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