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Type: TESE
Title: Purificação e caracterização bioquimica da polifenoloxidase (PPO)em fruto da anonacea Pinha (Annona squamosa L.)
Author: Lima, Eliza Dorotea Pozzobon de Albuquerque
Advisor: Pastore, Gláucia Maria, 1953-
Abstract: Resumo: As enzimas polifenoloxidases (PPO) são amplamente distribuídas na natureza, sendo primeiramente relacionadas com o escurecimento enzimático dos vegetais "in natura", ocasionando perda da cor dos produtos de frutas e hortaliças processados e ou congelados, diminuição do valor nutricional, modificando as propriedades organolépticas, resultando na maioria dos casos em produtos com aparência ruim, os quais são rejeitados pelos consumidores. Por outro lado, a PPO tem papel importante no desenvolvimento do sabor e cor dos alimentos como por exemplo do chá preto, diminuição do amargor e adstringência dos produtos do cacau e formação de aldeídos de aminoácidos. o objetivo do presente trabalho foi extrair, purificar e estudar as características bioquímicas da PPO (EC 1.10.3.2) de polpas de pinhas maduras (Annona squamosa L.), com a finalidade de obter informações necessárias à sua conservação com melhor qualidade organoléptica, bem como estudar a utilização da enzima no processamento de alimentos. O pH ótimo de atividade encontrado para a PPO parcialmente purificada foi 6,5 e para a enzima purificada 7,0, com pH de estabilidade entre 6,5 e 7,5. A temperatura ótima de atividade para a enzima parcialmente purificada e purificada foi 20°C. A enzima purificada apresentou rápida inativação em temperaturas acima de 50°C, quando incubada por 30 minutos, utilizando catecol como substrato. A PPO foi purificada 411 (Fração I) e 118 (Fração TI) vezes após cromatografia em coluna de troca iódica em DEAE-Toyopearl650M e 566 vezes em coluna de Toyopearl HW 5 5F. A enzima da fração mais ativa foi caracterizada bioquimicamente. A atividade enzimática, tanto da PPO parcialmente purificada como purificada, foi fortemente inibida pelos reagentes químicos glutationa, (3mercaptoetanol, L-cisteína, ácido ascórbico e metabissulfito de sódio e com menor intensidade para KCN e tiouréia nas concentrações de 1,5, 5,0 e 10,0 mM em relação ao volume final da mistura de reação, na temperatura de 20°C. Pouca inibição foi constatada com KCI, NaCI, ácido cítrico e EDTA nestas mesmas concentrações. No estudo comparativo entre tratamentos de inibição da PPO parcialmente purificada e purificada com concentrações de acordo com as permitidas pela legislação, o tratamento com ácido ascórbico 10mM e temperatura de 70°C durante dois minutos foi muito eficaz e adequado para substituir o uso de sulfitos. As enzimas parcialmente purificada e purificada utilizaram os ortodifenóis como substrato, não sendo detectado nenhum nível de atividade para monofenóis. Quanto aos parâmetros cinéticos, a enzima purificada apresentou valores de Km e). Vmax de 7,14 mM e 302,0 unidades/min/ml para catecol e 25,0 mM e 180,2 unidades/min/ml para L-dopa respectivamente, substratos que demonstraram maior especificidade. O peso molecular foi estimado em 90.000 daltons através de filtração em gel Sephadex G-200 e ao redor de 79.000 a 84.000 daltons através de SDS-PAGE. O teor de cobre da enzima purificada encontrado foi de llpprn/peso da amostra liofilizada. Quanto à composição de aminoácidos, a PPO apresentou maiores teores de ácido aspártico, ácido glutâmico e lisina e menores teores de metionina, arginina e tirosina, com ausência de cisteína. As enzimas parcialmente purificada e purificada apresentaram-se bastante estáveis quando armazenadas durante o período de 6 meses a -10°C

Abstract: Polyphenoloxidases (PPO) are widely distributed in nature, being first1y related to the enzymatic browning of vegetables "in natura", causing a loss of color in fruit products and processed or frozen vegetables, decrease in nutritional value and modification of the organoleptic properties, resulting in products with bad appearance, which are rejected by the consumers. On the other hand, PPO has an important role in the flavor and color of black tea, in the decrease of bittemess and astringency of cocoa products and in the formation of aldehydes from amino acids. The objective of the present work was to extract, purifyand study the biochemical characteristics ofthe PPO (EC 1.10.3.2) ofripe custard apple (Annona squamosa L.) pulps, with the purpose of obtaining the necessary information for the conservation of fruits pulps with better organoleptic properties, as well as to study the use of the enzyme in food processing. The optimum pH for activity of the partially purified PPO was 6.5 and for the purified enzyme 7.0, with pH stability between 6.5 and 7.5. The optimum temperature for activity of the partially purified and purified enzyme was 20°C. The purified enzyme showed fast inactivation at temperatures above 50°C, when incubated for 30 minutes with catechol substrate. PPO was purified 411 (Fraction I) and 118 (Fraction II) fold in an ion exchange column of DEAE-Toyopearl 650M, and 566 fold in a gel column of Toyopearl HW 55F. The enzyme of the most active fraction was characterized biochemically. The enzymatic activity of both the partially purified and purified PPO was strongly inhibited by the following reagents at concentrations of 1.5, 5.0 and 10. O mM with respect to the final volume of the reaction mixture, at a temperature of 20°C: glutathione, l3-mercaptoethanol, L-cysteine, ascorbic acid and sodium metabisulfite, and to a lesser extent by KCN and thiourea. Little inhibition was verified by KCI, NaCI, citric acid and EDTA. In a comparative study amongst the inhibition treatments for the partially purified and purified PPO, with concentrations in accordance with the limits permitted by the legislation, the treatment with 10mM ascorbic acid + temperature of 70°C for two minutes was effective and adequate to substitute the use of S02. The partially purified and purified enzyme used the 0diphenols as substrates and no activity towards monophenols was detected. With respect to the kinetic parameters, the purified enzyme presented values for Km and Vmax of 7.14 mM and 302.0 units/min/ml for catechol and 25.0 mM and 180.2 units/min/ml for L-dopa respectively, substrates which demonstrated greater specificity. The molecular weight was estimated as 90.000 daltons using gel filtration on Sephadex G-200 and about 79.000 to 84.000 daltons on SDS-PAGE. In the analysis of copper, the purified enzyme gave a value of l1ppm by weight ofthe liofilized sample. The amino acid composition of the custard apple fruit PPO, presented greater amounts of aspartic acid, glutamic acid and lysine and smaller amounts of methionine, arginine and tyrosine, with an absence of cysteine. Partially purified and purified PPO was stable during the period of 6 months of storage at -10°C
Subject: Piranonas
Annona squamosa
Purificação
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 1999
Appears in Collections:FEA - Dissertação e Tese

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