Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/255621
Type: TESE
Title: Diagnostico da contaminação por bacterias patogenicas em uma industria processadora de queijo de coalho e detecção de genes associados a fatores de virulencia
Title Alternative: Diagnostic foodborne pathogenic bacteria contamination in "coalho" cheese processing plant detection of virulence-associated genes
Author: Borges, Maria de Fatima
Advisor: Kuaye, Arnaldo Yoshiteru, 1952-
Abstract: Resumo: O queijo é considerado um veículo freqüente de patógenos de origem alimentar e, em especial os queijos frescos artesanais. Dentre estes, destaca-se o queijo de coalho por ser comumente elaborado a partir de leite cru e sob condições insatisfatórias de higiene, em pequenas indústrias que não adotam de forma plena as Boas Práticas de Fabricação (BPF). Portanto, a contaminação microbiológica deste produto assume destacada relevância para a saúde pública, pelo risco de causar doenças transmitidas por alimentos. Neste trabalho, foi realizado um diagnóstico da contaminação por coliformes fecais, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella sp. e Staphylococcus spp. na linha de produção de queijo de coalho em uma indústria de laticínios, na região metropolitana de Fortaleza - CE. Um total de 100 amostras de alimentos, incluindo leite cru, leite pasteurizado, coalhada, queijo, e 165 amostras ambientais, incluindo ar ambiente, superfícies de equipamentos, móveis, utensílios, embalagem de polietileno, drenos, pisos, paredes e luvas utilizadas pelos manipuladores, foi coletado durante a fabricação de cinco lotes diferentes, a intervalos de 45-50 dias, no período de maio a outubro de 2004. As amostras ambientais foram analisadas quanto à presença de L. monocytogenes, Staphylococcus spp., enquanto as amostras de alimentos, também, foram analisadas quanto ao número mais provável (NMP) de coliformes totais e fecais, pesquisa de E. coli e de Salmonella sp. A contagem e identificação das bactérias analisadas foi realizada pelos métodos preconizados pelo Bacteriological Analytical Manual (FDA), exceto para L. monocytogenes que foi analisada segundo metodologia do Canadiam Health and Food Branch. Os isolados característicos do gênero Listeria foram identificados utilizando-se o kit API® Listeria e por meio da amplificação de fragmentos dos genes hly e actA, utilizando a técnica PCR. Cem isolados característicos de Staphylococcus sp. foram identificados pelo sistema API ¿ Staph (BioMérieux) e os 23 isolados identificados como S. aureus foram confirmados através da amplificação de um fragmento do gene femA pela técnica da PCR. A pesquisa dos genes sea, seb, sec, sed, see, sei e sej foi realizada em 32 cepas de Staphylococcus, utilizando PCR. A detecção de enterotoxinas foi realizada em 20 amostras compostas, através do método imunoenzimático ELFA empregando o sistema automatizado VIDAS® Staph enterotoxin II (BioMérieux). O leite cru apresentou elevada população de bactérias do grupo coliformes totais e fecais, com confirmação da presença de E. coli, evidenciando deficiências nas condições higiênico-sanitárias durante o processo de obtenção do leite. A presença de E. coli não foi constatada no leite pasteurizado, na coalhada e no queijo. Os níveis de coliformes totais e fecais detectados apresentaram-se superiores ao limite legal estabelecido para queijo de coalho (1.0 x 103NMP/g) em apenas um lote. Em 100% das amostras dos alimentos analisadas verificou-se ausência de Salmonella spp. A avaliação de 18 isolados característicos do gênero Listeria através do kit API® Listeria revelou três isolados de L. monocytogenes ¿atípicas¿, que não foram confirmadas, uma vez que não apresentaram amplificação dos fragmentos específicos para os genes hly e actA, indicando assim a possível ausência desse patógeno no ambiente de produção de queijo de coalho. A população de Staphylococcus sp. e de Staphylococcus coagulase positiva reduziram de 1,5 x 107UFC/mL e 5,0 x 106UFC/mL no leite cru para zero e no leite pasteurizado, respectivamente. Staphylococcus coagulase positiva foi detectado em 100% das amostras de leite cru (25/25) e em 8% das amostras de queijos (2/25). As contagens de Staphylococcus sp. em equipamentos e utensílios oscilaram entre <102 a 3,2 x 104UFC/cm2. Identificou-se 12 espécies de Staphylococcus através do kit API® Staph, sendo nove coagulase negativa e três coagulase positiva. No leite cru observou-se alta freqüência de espécies coagulase positiva, com prevalência de S. aureus. Nas demais amostras de produtos, luvas dos manipuladores, superfícies de equipamentos e utensílios a prevalência foi de espécies coagulase negativa. A presença de enterotoxinas estafilocócicas foi constatada em todas as amostras de um mesmo lote processado, desde a matéria prima até o produto final (queijo). De um total de 23 cepas de S. aureus identificados fenotípicamente (API® Staph - BioMérieux), 82,6% (19/23) foram positivas para o gene femA, demonstrando maior especificidade e poder discriminatório da analise molecular. A presença dos genes sea e sec foi detectada em 37,5% (12/32) das cepas analisadas, sendo estas pertencentes a cinco espécies de Staphylococcus

Abstract: Cheese is considered to be a frequent vehicle of food borne pathogens, especially fresh artisan cheeses. Amongst these, ¿coalho¿ cheeses stand out since they are frequently made from non-pasteurised milk, under unsatisfactory conditions of hygiene, in small-scale industries that fail to completely adopt the Good Manufacturing Practices (GMP). Thus the microbiological contamination of this product assumes prominent relevance with respect to public health, due to the risk of transmitting foodborne diseases. In this study a diagnosis for the contamination by faecal coliforms, E. coli, L. monocytogenes, Salmonella sp. and Staphylococcus spp. was carried out on the ¿coalho¿ cheese production line of a dairy in the metropolitan region of Fortaleza ¿ CE, Brazil. A total of 100 samples were taken from 5 different batches processed at intervals of 45-50 days from May to October, 2004, and comprised non-pasteurised and pasteurised milks, curd, cheese and 145 environmental samples, including the air, equipment and utensils surfaces, drains, floors, walls and gloves worn by cheese handlers. The environmental samples were analysed for the presence of L. monocytogenes and Staphylococcus spp., whilst the food samples were also analysed for the most probable number (MPN) of total and faecal coliforms and examined for the presence of E. coli and Salmonella spp. The isolation and counts of the microorganisms analysed were carried out using the methods presented in the Bacteriological Analytical Manual (FDA), except for L. monocytogenes, which was analysed according to the Canadian Health and Food Branch methodology. Isolates characteristic of the genus Listeria were identified using the API® Listeria kit and by amplifying fragments of the genes hly and actA using the PCR technique. A hundred isolates characteristic of Staphylococcus sp., were selected for identification by the API® - Staph system (BioMérieux). Twenty-three S. aureus strains were identified at the molecular level by amplifying a fragment of the gene femA. A search for the genes sea, seb, sec, sed, see, sei and sej was carried out by PCR in 32 strains of Staphylococcus. Enterotoxin detection was carried out for 20 compound samples using the ELFA immuno-enzymatic assay with the automatated VIDAS® Staph enterotoxin II (BioMérieux). The non-pasteurised milk presented a high count of the total and faecal coliform group with confirmation of the presence of E. coli, as evidence of deficiencies in the hygiene-sanitary conditions during milking. E. coli was not found in the pasteurised milk, curd or cheese, and the levels of total and faecal coliforms found were above the legal limits for ¿coalho¿ cheese (103MPN/mL) for one single batch. Salmonella spp. were absent in 100% of the samples analysed. Eighteen isolates characteristic of the genus Listeria were evaluated using the API® Listeria kit, and three ¿atypical¿ isolates of L. monocytogenes were found. These did not present amplification of the fragments specific for the genes hly and actA, raising the possibility of their absence in the ¿coalho¿ cheese production environment. The Staphylococcus sp. Population decreased from 1.5 x 107CFU/mL in the raw milk to zero in the pasteurised milk, whilst coagulase positive Staphylococcus decreased from 5.0 x 106CFU/mL in the raw milk to zero in the pasteurised milk. Coagulase positive Staphylococcus was detected in 100% of the raw milk samples (25/25) and in 8% of the cheese samples (2/25). Staphylococcus sp. counts oscillated between <102 and 3.2 x 104CFU/cm2 on the equipment and utensils. Both coagulase positive and negative Staphylococcus species were identified on the gloves of the cheese handlers. Twelve species of Staphylococcus were identified, 9 being coagulase negative and 3 being coagulase positive. A high frequency of coagulase positive species was observed in the raw milk, with prevalence for S. aureus. The prevalence of coagulase negative species was verified in the other samples of product, handlers¿ gloves, equipment and utensils surfaces. Staphylococcal enterotoxins were found in all the samples from one particular batch, from the raw material to the final product (cheese). Out of a total of 23 strains of S. aureus phenotypically identified (API® Staph ¿ BioMérieux), 82.6% (19/23) were positive for the gene femA, demonstrating the greater specificity and discriminatory power of the molecular analysis. The presence of the genes sea and sec was detected at a level of 37.5% (12/32) of the strains analysed of 5 Staphylococcus species
Subject: Listeria monocytogenes
Enterotoxinas
Estafilococos
Virulencia
Queijo
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2006
Appears in Collections:FEA - Dissertação e Tese

Files in This Item:
File SizeFormat 
Borges_MariadeFatima_D.pdf883.22 kBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.