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Type: TESE DIGITAL
Title: Prospecção, clonagem, produção, purificação e caracterização de enzimas do sistema lignocelulolítico de Bacillus licheniformis CBMAI 1609
Title Alternative: Screening, cloning, production, purification and characterization of enzymes from the lignocellulolytic system of Bacillus licheniformis CBMAI 1609
Author: Lima, Evandro Antônio de, 1985-
Advisor: Sato, Helia Harumi, 1952-
Abstract: Resumo: As celulases, hemicelulases, pectinases e lacases são um importante grupo de enzimas que são produzidas comercialmente e que apresentam diversas aplicações industriais. A utilização dessas enzimas em processos para conversão de materiais lignocelulósicos em biocombustíveis e outros produtos de alto valor agregado tem recebido grande notoriedade nas pesquisas científicas. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivos realizar a prospecção, clonagem, produção, purificação e caracterização de enzimas lignocelulolíticas a partir de um isolado do gênero Bacillus. Inicialmente foi realizada uma avaliação do potencial produtor de celulases, pectinases e xilanases de 107 isolados de Bacillus sp. obtidos a partir de amostras de sucos de frutas pasteurizadas. Nessa etapa do trabalho, 20 isolados mostraram-se capazes de produzir as 3 enzimas e foram identificados como linhagens de B. licheniformis e B. subtilis. O isolado com melhor potencial hemicelulolítico foi selecionado para as etapas seguintes desse trabalho e depositado como B. licheniformis CBMAI 1609. Posteriormente, foram realizados vários experimentos visando otimizar e aumentar a escala de produção de xilanase. Esses experimentos possibilitaram o uso de subprodutos agroindustriais como substratos indutores para a produção de xilanase, sendo os melhores resultados observados com uma combinação de bagaço de laranja e farelo de soja. Além disso, foi possível com esses experimentos aumentar a produção da enzima cerca de 61,6 vezes em relação aos resultados iniciais (de 0,3 U/mL para 18,5 U/mL), reduzir o tempo de fermentação e os custos de obtenção da enzima (de R$ 368,53 para R$ 0,21 para cada 1.000 U de xilanase) e ainda produzir simultaneamente outras hidrolases glicosídicas. O sistema xilanolítico produzido por esse micro-organismo foi caracterizado e apresentou altos níveis de atividade em condições neutras à alcalinas e em temperaturas próximas a 50 ºC. Um estudo para purificar as hidrolases glicosídicas produzidas pelo micro-organismo foi executado e revelou a presença de um complexo multienzimático com mais de 1.300 kDa, composto por pelo menos 10 subunidades proteicas e que hidrolisava principalmente substratos hemicelulósicos. Foi ainda realizado o isolamento e a clonagem de genes que codificavam as enzimas arabinanase, ?-L-arabinofuranosidase, endoglucanase, galactanase, lacase e ramnogalacturonase no micro-organsimo selecionado. Neste trabalho é relatada a expressão heteróloga, a purificação e a caracterização de duas endoglucanases, uma galactanase e uma lacase. A caracterização das endoglucanases e da galactanase indicou que essas enzimas apresentavam pH ótimo de atividade próximo da neutralidade, eram estáveis em temperaturas abaixo de 50 ºC após 1 hora de tratamento térmico, mantinham mais de 70% de atividade residual após 24 horas de incubação na faixa de pH entre 4,0 a 8,0 e exibiam boa eficiência catalítica. A lacase exibiu atividade ótima em temperaturas entre 55 e 60 ºC e em pH 4,0. Essa enzima também mostrou baixa estabilidade após incubação prévia em valores de pH abaixo de 5,0 e apresentou eficiência catalítica similar a outras lacases. A suplementação de um coquetel enzimático comercial com a galactanase foi também avaliada e revelou que a adição dessa enzima proporcionava uma melhora de aproximadamente 25% no rendimento da hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

Abstract: Cellulases, hemicellulases, pectinases and laccases are an important group of enzymes which are produced commercially and have various industrial applications. The use of these enzymes in the conversion of plant biomass into biofuels and other value added products has received great notoriety in scientific research. In this context, the present study aimed to carry out the screening, cloning, production, purification and characterization of the lignocellulolytic enzymes from an isolate of Bacillus genus. Initially, the screening for potential producer of cellulases, pectinases and xylanases was performed from 107 isolates of Bacillus sp. obtained from pasteurized fruit juices samples. At this stage, 20 isolates were able to produce the three enzymes and have been identified as B. licheniformis and B. subtilis strains. The isolated with the best hemicellulolytic potential was selected for the next steps of this work and deposited as B. licheniformis CBMAI 1609. Subsequently, tests were performed to optimize the production of xylanase and to expand the scale of enzyme production. These experiments demonstrated that agricultural by-products could be used as substrate to induce the xylanase production. The best results were obtained combining orange pomace and soybean meal. A 61.6-fold increase in enzyme activity compared to the initial results (0.3 U/mL to 18.5 U/mL) as well the reduction in costs to obtain the enzyme (from R$ 368.53 to R$ 0.21 per 1,000 U of xylanase) and fermentation time were also observed. The optimization of the fermentation process also allowed the simultaneous production of other glycoside hydrolases by the microorganism. The xylanolytic system produced by this microorganism showed higher levels of activity in neutral to alkaline conditions and at temperatures around 50 °C. The purification of the glycoside hydrolases produced by the microorganism revealed a multienzyme complex superior to 1,300 kDa. It is composed of at least 10 proteins which are involved mainly in the hydrolysis of hemicelluloses. The isolation and cloning genes that encode the enzymes arabinanase, ?-L-arabinofuranosidase, endoglucanase, galactanase, laccase e rhamnogalacturonase in B. licheniformis CBMAI 1609 also was performed. In this work two endoglucanases, a galactanase and a laccase were expressed in heterologous system, purified and characterized. The endoglucanases and the galactanase showed optimal activity close to neutrality and stability at temperatures below 50 °C after 1 hour of heat treatment. These enzymes kept over 70 % of residual activity after incubation for 24 hours in the pH range 4.0 to 8.0 and also exhibited good catalytic efficiency. The laccase showed optimal activity between 55 and 60 °C and pH 4.0. This enzyme also exhibited low stability after previous incubation at pH values below 5.0 and had similar catalytic efficiency to other laccases. The effect of commercial enzyme cocktail supplementation with galactanase was also evaluated. The supplementation led to an improvement of approximately 25 % in the hydrolysis yield of pretreated sugarcane bagasse
Subject: Glicosideo hidrolases
Lignocelulose
Bacillus licheniformis
Produção
Caracterização
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2015
Appears in Collections:FEA - Tese e Dissertação

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