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Type: TESE
Title: Avaliação comparativa de procedimentos de extração de proteinas em plantas medicinais e fitoterapicos e quantificação de metais associados a essas proteinas
Title Alternative: Comparative evaluation of protein extraction procedures in medicinal plants and phytomed and quantitation of associated metals to these proteins
Author: Magalhães, Cristiana Schmidt de
Advisor: Arruda, Marco Aurelio Zezzi, 1965-
Abstract: Resumo: Este trabalho de Tese apresenta os resultados da avaliação de onze procedimentos de extração de proteínas nas plantas medicinais ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.) e castanha da Índia (Aesculus hippocastanum) e no fitoterápico Espirulina (Spirulina maxima). Os procedimentos variaram desde a simples agitação até àqueles onde se somavam várias etapas, tais como agitação, maceração, sonicação e centrifugação. A avaliação foi feita em termos da comparação da concentração de proteínas totais extraídas por meio de cada procedimento, utilizando-se o método de Bradford e de Kjeldhal. Os procedimentos contendo mais etapas se mostraram mais eficientes na extração de proteínas. Também foi feito o mapa protéico da castanha da Índia (Aesculus hippocastanum) e avaliada a influência dos procedimentos de extração de proteínas no perfil protéico da referida amostra. Para isso foi feita a separação das proteínas presentes nos extratos protéicos utilizando-se eletroforese SDS-PAGE. Esta separação (para as proteínas desnaturadas e sob condição não-redutora) permitiu identificar, em termos de massa molar, quais proteínas compunham os extratos protéicos, onde se verificou uma banda mais expressiva (MM = 33,2 ± 0,9 kDa), independentemente do procedimento de extração usado, fato que foi relacionado à mobilidade da proteína. Quando a separação ocorria sob condições redutoras, a banda mais expressiva apresentava MM = 23,5 ± 0,5 kDa. Com a finalidade de se fazer uma investigação mais detalhada, as proteínas da castanha da Índia que foram extraídas pelo procedimento de maceração e centrifugação, foram também separadas por eletroforese bidimensional, na qual houve o desdobramento da banda mais expressiva em pelo menos nove bandas protéicas. Estas bandas foram decompostas tripticamente e foram analisadas por espectrometria de massas, com a obtenção de várias seqüências peptídicas que se repetiam em várias bandas diferentes. Estes resultados sugerem que estas proteínas se tratam de isoformas. Finalmente, foi proposta a identificação de quais íons metálicos estariam ligados às proteínas, o que foi possível por meio do mapeamento das bandas protéicas utilizando-se a fluorescência de raios-X com radiação Síncrotron. Foram identificados 4 íons metálicos, os quais foram investigados quantitativamente. As bandas separadas por SDS-PAGE e por 2D-PAGE foram decompostas por radiação microonda e a determinação das concentrações dos íons metálicos foi obtida por ETAAS e FAAS. Para as bandas separadas por 2D-PAGE observou-se uma interessante distribuição não homogênea dos íons metálicos, sugerindo que algumas se trataram de metaloproteínas, enquanto outras não. Assim, estas proteínas podem ser de origem citosólica e de armazenamento, e que, embora sejam apenas coadjuvantes na ação medicinal da castanha, participariam ativamente nos processos germinativos e metabólicos da planta.

Abstract: This work presents the evaluation of eleven protein extraction procedures using ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.), horse chestnut (Aesculus hippocastanum) medicinal plants, and also using the phytomedicine Spirulina (Spirulina maxima). The procedures varied since the agitation only until the addition of several steps, such as agitation, maceration, sonication, and centrifugation. This evaluation was made by comparing the total extracted proteins through Bradford and Kjeldhal methods. The more efficient protein extraction procedures were those whose steps were added. The influence of protein extraction procedures was also evaluated in the protein map of horse chestnut (Aesculus hippocastanum). The proteins present in extracts were separated by SDS-PAGE. This separation (for denatured and non-reduced proteins) allowed identifying the more expressive protein band (MM = 33.2 ± 0.9 kDa) independently of the used procedure. When the separation was carried out under reduced and denatured conditions, the more expressive protein band had MM = 23.5 ± 0.5 kDa. This difference in MM was attributed to protein mobility. The horse chestnut proteins extracted by maceration and centrifugation were also separated by twodimensional electrophoresis in order to obtain a more detailed protein profile. Through this separation, the more expressive band was folded in, at least, nine protein bands. These bands were triptically decomposed and analysed by mass spectrometry. Several peptide sequences that repeated in different protein bands were obtained. These results suggested to deal of isoforms. Finally, the identification of metallic ions bonded to proteins, using Sincrotron radiation- X-ray fluorescence was also proposed. Four metallic ions were identified, which were quantitaively investigated. The protein bands separated by SDS-PAGE and by 2D-PAGE were decomposed using microwave radiation, and metallic ion concentrations were determined by ETAAS and FAAS techniques. For 2D-PAGE bands an interesting non-homogeneous metallic ion distribution was observed, suggesting that some proteins can be metalloproteins or metal-binding proteins. Therefore, these studied proteins probably present a citosolic origin and storing function. However, they may be coadjuvants at medicinal action, and much probably participate in germinating and metabolic processes.
Subject: Extração de proteinas
Proteínas
Metaloproteinas
Isoformas
Language: Português
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2008
Appears in Collections:IQ - Tese e Dissertação

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