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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Nanopartículas lipídicas sólidas para carreamento de genes : endocitose, tráfego intracelular e toxicidade em cultura de células = Solid lipid nanoparticles for gene delivery: endocytosis, intracellular trafficking and toxicity in cell culture
Title Alternative: Solid lipid nanoparticles for gene delivery : endocytosis, intracellular trafficking and toxicity in cell culture
Author: Radaic, Allan, 1986-
Advisor: Jesus, Marcelo Bispo de, 1980-
Abstract: Resumo: A nanomedicina é a aplicação da nanotecnologia na área da saúde. Uma das aplicações que tem se destacado é o uso carreamento de ácidos nucleicos para fins terapêuticos, com objetivo de reparar sistemas biológicos. Essa terapia possibilitaria, por exemplo, novas formas de tratamento para doenças que as terapias convencionais não são eficientes. Para tal, se faz necessário a modificação genética de uma célula, processo conhecido como transfecção. Essa técnica é utilizada para o estudo das funções de proteínas e vias de sinalização celular, através do silenciamento da expressão proteica ou a expressão de genes mutantes ou proteínas recombinantes. Para que o material genético promova tal efeito biológico, nanocarreadores se fazem necessários. Após internalização, o complexo de nanopartículas com material genético inicia o tráfego intracelular. Para haver um entendimento mais profundo sobre os mecanismos moleculares de transfecção é necessário: uma maior compreensão das nanopartículas (isto é, da estrutura e características físico-químicas do nanocarreador), assim como essas nanopartículas interagem com processos biológicos, como internalização e tráfego intracelular. Desta forma o objetivo deste trabalho foi estudar o uso de nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) para o carreamento de genes em células eucarióticas. Iniciamos o estudo revisando a literatura sobre o efeito do núcleo lipídico nas nanopartículas lipídicas para o carreamento de fármacos e de genes. Em seguida, otimizamos a formulação de NLS desenvolvida anteriormente através de um planejamento fatorial incompleto 23 e a formulação anterior como ponto central. Interessantemente, a formulação otimizada encontrada foi muito similar ao ponto central. Com isto, decidimos manter a formulação original no restante do estudo. Então, revisamos a literatura sobre como estudar a interação entre nanopartículas e células e, por fim, analisamos a internalização e tráfego intracelular de NLS em células HEK293T. Demostramos que as NLS são internalizada através da via dependente de clatrina, com pico de co-localização com esta proteína após 2h de internalização, seguindo para o lisossomo, com o pico de co-localização com a proteína LAMP1 após 6h de internalização. Então, mostramos que a acidificação endo-lisosomal é um dos fatores chaves na liberação do material genético carreado pela NLS através da simulamos a acidificação endo-lisosomal in vitro, evidenciando a liberação >80% do material genético em pH 4.0. Espera-se que este estudo amplie os entendimentos sobre as bases moleculares da transfecção e que possa ajudar no uso desses materiais na nanomedicina

Abstract: Nanomedicine is the application of nanotechnology in healthcare. One of its applications is the use of nucleic acids for repairing biological systems. Such therapy would enable new forms for the treatment of diseases that conventional therapies are not efficient. To do this, genetic modification of cells is required, a process known as transfection. This technique used to study the function of proteins and cell signaling pathways, through protein expression silencing or expression of mutant genes expression or recombinant proteins. To nucleic acid promote such biological effect, nanocarriers are needed. After being internalized, the complex of nanoparticle and genetic material initiates the intracellular traffic. To reach a more in-depth knowledge about the molecular mechanisms of transfection, it is necessary a further understanding of the nanoparticles (i.e., nanocarrier structure and physical-chemical characterization) and how these nanoparticles interact with biological processes, such as internalization and intracellular trafficking. Therefore, the objective of this work was to study the use of solid lipid nanoparticles (SLN) for gene delivery in eukaryotic cells. We started the study by reviewing the literature on the effect of the lipid core of lipid nanoparticles for drug and gene delivery. Next, we optimized the SLN formulation containing DOTAP, stearic acid and Pluronic F68TM through an incomplete 23 factorial design with the previously developed SLN formulation as a center point. Interestingly, the optimized formulation was very similar to the central point. With this result, we decided to keep the original formulation through the rest of the study. Then, we reviewed the literature on how to study the interaction between nanoparticles and cells. Finally, we analyzed SLN internalization and intracellular traffic in HEK293T cell line. We demonstrate that SLN are mainly internalized through the clathrin-dependent pathway, which co-localize peaked at 2h of internalization. Next, SLN reached the lysosome, where LAMP1 co-localization peaked at 6h of internalization. Subsequently, we show that endosome-lysosomal acidification is one of the key factors for DNA release from SLN. We simulated the endosome-lysosomal acidification in vitro, which evidenced the release of >80% of the genetic material at pH 4.0. We hope that this study will bring more understanding of the molecular basis of transfection and may assist in the use of these materials in nanomedicine
Subject: Nanopartículas lípidicas solidas
Transfecção
Terapia genética
Célula eucariótica
Language: Inglês
Editor: [s.n.]
Date Issue: 2018
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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