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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Estudo biossintético de clusters relacionados ao metabolismo secundário de Streptomyces sp. B1
Title Alternative: Biosynthetic studies of clusters related to secondary metabolism of Streptomyces sp. B1
Author: Paulo, Bruno Sacchetto, 1990-
Advisor: Oliveira, Luciana Gonzaga de
Abstract: Resumo: Os microrganismos são fontes prolíficas de produtos naturais bioativos. Muitos desses organismos são responsáveis por produzir fármacos de grande importância nos dias de hoje sendo que o gênero Streptomyces representa um dos maiores produtores de moléculas com atividade antibiótica. O microrganismo endofítico Streptomyces sp. B1, isolado de Citrus spp., se mostrou ativo em ensaios de inibição frente a algumas linhagens patogênicas despertando interesse em relação ao seu metabolismo secundário. Para melhor conhecer o seu potencial biossíntetico essa actinobactéria foi completamente sequenciada utilizando-se a tecnologia Ilumina e uma análise bioinformática de seu genoma através da plataforma antiSmash permitiu a identificação de 37 clusters de genes para o metabolismo secundário, entre eles foi possível identificar terpenos sintases, NRPS (sintetase de peptídeo não ribossomal), butirolactonas, tiopeptideos sintases, PKSs (sintases de policetídeos) do tipo I, II e III, além de híbridos entre PKS-NRPS. O objetivo desse trabalho é caracterizar a funcionalidade de um cluster que codifica provavelmente para um grupo de enzimas relacionadas a biossíntese de tiopeptídeos que possuem ampla atividade antibiótica. Para isso foi construída uma biblioteca genômica utilizando como vetor o pESAC13A, o qual foi introduzido em E. coli DH10B. Os organismos recombinantes, contendo a informação referente a tiopeptídeo sintase foram então selecionados por PCR e transferidos para 2 linhagens geneticamente engenheiradas de Streptomyces coelicolor (M1146 e M1152). O perfil metabólico foi avaliado e indica a produção de um metabólito derivado de peptídeo. Para entender qual a funcionalidade de um domínio de adenilação envolvido na biossíntese desse provável peptídeo ribossomal, realizamos também a deleção gênica desse fragmento na linhagem selvagem de forma a interromper sua produção ou gerar algum análogo biossíntetico. A análise de seu perfil metabólico em comparação à linhagem selvagem indicam uma diferença no perfil metabólico e além disso foi observado um aumento na produção de valinomicina, um ionóforo codificado por uma sintetase de peptídeo não ribossomal. Para estabelecer em nosso grupo um procedimento de transferência de grandes fragmentos de genes, foi utilizado um método rápido de clonagem in vitro baseado na metodologia isotérmica de assembly para obter um derivado do plasmídeo pSET152 com 25 kbp contendo a sintetase de peptídeo não ribossomal (NRPS) responsável pela biossíntese da indigoidina. Esse plasmídeo organizado inicialmente em E. coli DH10B foi transferido para 3 linhagens geneticamente engenheiradas de Streptomyces coelicolor (M1146, M1152 e M1154), e as integrações foram confirmadas por PCR. Com o término desse trabalho estabelecemos um método para a transferência completa de genes biossínteticos para organismos heterólogos e realizamos deleções genéticas de orfs essenciais para uma via específica que possibilitou entender mais sobre sua funcionalidade global em Streptomyces sp. B1

Abstract: Microorganisms are prolific sources of natural bioactive products. Many of these organisms are responsible for producing drugs of great importance these days and the genus Streptomyces represents one of the largest producers of molecules with antibiotic activity. The endophytic microorganism Streptomyces sp. B1, isolated from Citrus spp., was active in inhibition assays against some pathogenic strains, arousing interest in its secondary metabolism. To better understand its biosynthetic potential, this bacteria was completely sequenced using Ilumina technology and a bioinformatic analysis of its genome through the antiSmash platform allowed the identification of 37 gene clusters for secondary metabolism. Among the gene clusters it was possible to identify terpenes synthases, NRPS (Non Ribosomal Peptide synthetase), butyrolactones, thiopeptide synthases, PKSs (Polyketide synthases) type I, II and III and hybrids between PKS-NRPS. The objective of this work is to characterize the functionality of a cluster that probably encodes for enzymes related to thiopeptides biosynthesis, known for the wide spectrum antibiotic activity. A genomic library was constructed using pESAC13A as vector and introduced into E. coli DH10B. Recombinant organisms were then selected by PCR and transferred to 2 genetically engineered strains of Streptomyces coelicolor (M1146 and M1152). The metabolic profile was evaluated and indicate the production of a peptidic metabolite. In order to understand the functionality of an adenylation domain involved in the biosynthesis of this probable ribosomal peptide, we also carried out the deletion of this fragment in the wild type to interrupt its production or generate some biosynthetic analogue. comparison of the metabolic profile indicates a clear difference between wild type and the deleted mutant in addition to an increase in valinomycin production (nonribosomal peptide sinthetase codified ionophore). To establish a large gene fragment transfer protocol in our group, a rapid in vitro cloning method based on the isothermal assembly methodology was used to obtain a derivative of the 25 kbp plasmid pSET152 containing the non-ribosomal peptide synthetase responsible for the biosynthesis of indigoidine, this plasmid initially cloned into E. coli DH10B was transferred to 3 genetically engineered strains of Streptomyces coelicolor (M1146, M1152 and M1154), whose blots were confirmed by PCR. At the end of this work we established a method for the complete transfer of biosynthetic genes to heterologous organisms and in addition, we performed genetic deletions of essential orfs related to specific pathways that made it possible to understand more about its functionality
Subject: Mineração do genoma
Expressão heteróloga
Peptídeo não ribossomal
Deleção de genes
Editor: [s.n.]
Citation: PAULO, Bruno Sacchetto. Estudo biossintético de clusters relacionados ao metabolismo secundário de Streptomyces sp. B1. 2017. 1 recurso online ( 80 p.). Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/331623>. Acesso em: 1 set. 2018.
Date Issue: 2017
Appears in Collections:IQ - Tese e Dissertação

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