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Tipo: TESE DIGITAL
Título: Análise do secretoma de Pseudozyma brasiliensis e clonagem, expressão e caracterização de hemicelulases = Secretome analysis of Pseudozyma brasiliensis and cloning, expression and characterization of hemicellulases
Título(s) alternativo(s): Secretome analysis of Pseudozyma brasiliensis and cloning, expression and characterization of hemicellulases
Autor(es): Kaupert Neto, Antonio Adalberto, 1991-
Abstract: Resumo: Atualmente, o uso de etanol como fonte de energia atrai o interesse de investimentos por ser inesgotável e de baixo impacto ambiental. No Brasil, a matéria-prima para sua produção é a cana-de-açúcar (cana), que gera como subproduto o bagaço. Este material lignocelulósico (formado principalmente por celulose, hemicelulose e uma menor porcentagem de outros compostos) pode ser utilizado para a produção do etanol de segunda geração. A hemicelulose da cana é composta por polímeros de pentoses e, para sua redução à monômeros fermentescíveis, é necessário principalmente duas enzimas hidrolíticas: a xilanase e beta-xilosidase. Em busca de novos microrganismos produtores destas enzimas, nosso grupo recentemente identificou uma nova espécie de levedura xilanolítica, denominada Pseudozyma brasiliensis (atual Kalmanozyma brasiliensis). Assim, este projeto teve como principal objetivo o estudo do secretoma desta espécie e caracterização de beta-xilosidases. Como resultado, o seu secretoma apresentou atividade referente a uma pequena gama de enzimas, porém interessantes para a quebra da parede celular vegetal, tais como xilanase, beta-xilosidase, beta-glicosidase e mananase. Por espectrometria de massas, além das enzimas que putativamente são responsáveis por estas atividades, também foram identificadas outras com atividades auxiliares e esterases. Em relação a beta-xilosidase, foram identificadas duas possíveis candidatas pertencentes à família 3 das glicosil hidrolases, secretadas apenas em xilano (GH3_80 e GH3_98). Com o objetivo de caracterizá-las, as expressões heterólogas destas enzimas foram realizadas em Escherichia coli, entretanto, estas se apresentaram insolúveis e inativas, provavelmente devido às modificações pós traducionais que estas cepas são incapazes de realizar. Em seguida, a GH3_80 foi produzida heterologamente em Pichia pastoris e os resultados sugerem que ela possui atividade de beta-glicosidase e beta-xilosidase. Adicionalmente, uma xilanase da família 11 foi produzida heterologamente em E. coli, purificada, cristalizada, caracterizada estruturalmente por cristalografia de raios-x. Além disso, esta xilanase está entre as 3 enzimas com maior atividade específica já registrada no BRENDA, com valores próximos a 11500 U/mg

Abstract: Currently, ethanol production is attracting investments since it represents a renewable energy source with few environmental impacts. In Brazil, ethanol is produced from sugarcane, generating bagasse as a byproduct. This lignocellulosic biomass can be used for the production of so-called second generation ethanol. The hemicellulose of sugarcane is composed mostly of pentose polymers, and to reduce it to fermentable monomers, it is necessary mainly two hydrolytic enzymes: endo-xylanase and beta-xylosidase. In search of for new sources of these enzymes, our group recently identified a new species of a xylanolytic yeast-like fungi called Pseudozyma brasiliensis (current Kalmanozyma brasiliensis). Therefore, the main objective of this project was to study the K. brasiliensis secretome and characterize beta-xylosidases. Its secretome showed activity realated to a small range of enzymes, but very interesting for breaking the plant cell wall, such as endo-xylanase, beta-xylosidase, beta-glucosidase and endo-mannanase. In addition to the enzymes that are putatively responsible for these activities, the mass spectrometry analysis also identified enzymes with auxiliary and esterase activities. Regarding beta-xylosidase, two possible candidates belonging to family 3 of the glycoside hydrolases,(GH3_80 and GH3_98) were identified secreted only on xylan. In order to characterize them, the heterologous expression of these enzymes were performed in Escherichia coli; however, the proteins presented insoluble and inactive, probably due to the post-translational modifications which are not performed in E. coli. Then GH3_80 was successfully produced in Pichia pastoris and the results suggest that it has beta-glucosidase and beta-xylosidase activity. Additionally, an endo-xylanase from glycoside hydrolase family 11 was produced heterologously in in E. coli, purified, crystallized and structurally characterized by x-ray difraction. The data o kinetics suggest that this xylanase is among the 3 enzymes with the highest specific activity already registered in BRENDA, with values close to 11500 U/mg
Palavras-chave: Secretoma
Clonagem
Expressão heteróloga
Enzimas
Caracterização
Idioma: Multilíngua
Editor: [s.n.]
Citação: KAUPERT NETO, Antonio Adalberto. Análise do secretoma de Pseudozyma brasiliensis e clonagem, expressão e caracterização de hemicelulases = Secretome analysis of Pseudozyma brasiliensis and cloning, expression and characterization of hemicellulases. 2016. 1 recurso online (153 p.). Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP.
Data do documento: 2016
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