Orientador: Elias Basile Tambourgi

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química

Resumo: A indústria catalítica possui as enzimas proteolíticas como uma das mais importantes classes de produtos do mercado global, uma vez que representam mais de 65% do mercado total de enzimas. Estas exibem importantes funções no processo metabólico das células, além de serem investigadas,...

Resumo: A indústria catalítica possui as enzimas proteolíticas como uma das mais importantes classes de produtos do mercado global, uma vez que representam mais de 65% do mercado total de enzimas. Estas exibem importantes funções no processo metabólico das células, além de serem investigadas, principalmente as enzimas extracelulares, para aplicações industriais, como a de alimentos e em aplicações detergentes. Contudo, os métodos de separação e purificação envolvem inúmeras etapas, demandando um longo tempo de execução e tornando-os onerosos, uma vez que podem atingir 70-90% do custo total da produção. Assim, novas estratégias econômicas e eficientes para os downstream processes devem ser desenvolvidas para atender as exigências da indústria. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi investigar a purificação e a caracterização bioquímica da protease produzida por Aspergillus terreus VSP-22. As técnicas de precipitação foram realizadas a 20, 40, 60 e 80% de saturação. A precipitação com etanol alcançou uma atividade específica de 174,19 U.mL-1 e um fator de purificação de 15,05 vezes, a 80% de concentração, porém a recuperação atingiu 41,05% nesta fração. A precipitação com sulfato de amônio, a 60% de saturação, mostrou 46,45% para recuperação e 2,07 vezes para o fator de purificação. Um planejamento fracionário (24) para extração em sistema bifásico aquoso foi realizado, a fim de avaliar o efeito da massa molar de polietileno glicol (PEG), as concentrações de PEG e sulfato de amônio, volume da amostra e pH. O melhor fator de purificação (4,65 vezes) foi obtido com 18% (w/w) de PEG 2000 (g/mol), 18% (w/w) de sulfato de amônio a pH 9,8 e 0,5 mL de volume da amostra, o qual mostrou uma recuperação de 59,03%. A metodologia de superfície de resposta foi realizada para examinar os efeitos das concentrações de PEG e sulfato de amônio, e observou-se que o maior fator de purificação (5,16) e recuperação (70,82%) foram no ponto central. O sistema bifásico aquoso otimizado teve sua escala aumentada 8 e 64 vezes, os quais evidenciaram conformidade com as atividade específica (109,71 e 109,87 U.mg-1) e recuperação (69,40 e 70,60%, respectivamente). A caracterização bioquímica encontrou um pH ótimo de 9,0 e temperatura de 50 °C para extrato enzimático, já para protease purificada, um ótimo de pH 9,8 e 40 °C. Os parâmetros cinéticos evidenciaram a alta afinidade da protease purificada para azocaseína (Vmax = 24,4499 U.mL-1 e Km = 0,0318 mM). Portanto, além das técnicas de purificação terem sido eficientes, a protease demonstrou ter propriedades interessantes, sugerindo seu potencial em aplicações industriais

Abstract: Enzyme industry has proteases as one of the most important classes of global market products, account for more than 65% of the total enzyme market. Peptidases display essential role in metabolic process of cells, in addition have been investigated, mainly extracellular peptidases, to...

Abstract: Enzyme industry has proteases as one of the most important classes of global market products, account for more than 65% of the total enzyme market. Peptidases display essential role in metabolic process of cells, in addition have been investigated, mainly extracellular peptidases, to applications on industries as food and detergent applications. However, the bottleneck of production is found on downstream processes, which involve innumerous steps, are costly and time-consuming and can attain 70-90% of total production costs. Thus, new cost-effective and efficient strategies for downstream processes have to be improved to attend industries where peptidases are requested. In this way, the aim of the present work was to investigate the purification and biochemical characterization of protease produced from Aspergillus terreus VSP-22. The techniques of precipitation were performed at 20, 40, 60 and 80% of saturation. Ethanol precipitation achieved a specific activity of 174.19 U.mL-1 and a purification factor of 15.05-fold at 80% concentration, however recovery attained 41.05% in this fraction. Ammonium sulphate precipitation at 60% saturation showed 46.45% on recovery and 2.07-fold on purification factor. The 24 factorial design of aqueous two-phase system (ATPS) was performed to evaluate the effect of polyethylene glycol (PEG) molar mass, PEG and ammonium sulphate concentrations, sample volume, and pH. The best purification factor (4.65-fold) was obtained with 18% (w/w) PEG 2000 (g/mol), 18% (w/w) ammonium sulphate at pH 9.8 and 0.5 mL of sample volume, showing a recovery of 59.03%. Response Surface Methodology was conducted in order to examine PEG and ammonium sulphate concentrations effects, and it was observed that a higher purification factor (5.16-fold) and recovery (70.82%) in the center point. The optimized ATPS was scaled up 8 and 64 fold and their behaviour were in agreement with specific activity (109.71 and 109.87 U.mg-1) and recovery (69.40 and 70.60%, respectively). The biochemical characterization found an optimum pH of 9.0 and temperature of 50 °C for enzyme extract, whereas for purified protease an optimum of 9.8 pH and 40 °C. Kinetic parameters evidenced the high affinity of purified protease for azocasein (Vmax = 24.4499 U.mL-1 and Km = 0.0318 mM). In this way, the purification techniques were efficient and protease has proven to have interesting properties, suggesting its potential in industrial application

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