Orientador: Aline Carvalho da Costa

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química

Resumo: Este trabalho teve como foco o estudo do mecanismo de inibição por produto no processo de hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar com a enzima ?-glucosidase de Aspergillus niger e o complexo celulolítico Celluclast 1.5L de Trichoderma reesei. Os substratos utilizados nos...

Resumo: Este trabalho teve como foco o estudo do mecanismo de inibição por produto no processo de hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar com a enzima ?-glucosidase de Aspergillus niger e o complexo celulolítico Celluclast 1.5L de Trichoderma reesei. Os substratos utilizados nos experimentos foram celobiose, bagaço de cana-de-açúcar submetido ao pré-tratamento hidrotérmico (BH) e organossolve (BO). Foi empregado glucono-?-lactona como inibidor da enzima ?-glicosidase presente no complexo celulolítico a fim de evitar a conversão de celobiose em glicose no meio reacional. A concentração de glucono-?-lactona, assim como o tempo de incubação deste com o coquetel enzimático, foram determinados por meio de um planejamento fatorial 32. Para a determinação da cinética de inibição por produto da enzima ?-glucosidase e a Celluclast 1.5L foram feitos ensaios nas seguintes condições: concentração de celobiose (substrato) de 0,5-10 g/L e 0-10 g/L de glicose (inibidor), concentração de bagaço pré-tratado 0,1-8 % m/v (substrato), xilose 0-10 g/L (inibidor) e glicose 0-60 g/L (inibidor), respectivamente. Os experimentos foram executados em pH 4.8, durante 1h, temperatura de 50 °C, agitação de 150 rpm e carga enzimática fixada em 0,0767 CBU/mL para o estudo de inibição por glicose na enzima ?-glucosidase e de 50 FPU/mL para o estudo de inibição por glicose e xilose na enzima celulase. No decorrer das hidrólises foram coletadas alíquotas de 1mL do líquido reacional e para a quantificação dos carboidratos liberados a concentração foi determinada em um sistema de CLAE. O estudo de inibição por glicose na ?-glicosidase de Aspergillus niger (Novozym188) com D(+)-Celobiose como substrato revelou que esta enzima é inibida competitivamente pela glicose. A constante de inibição Ki foi 3,825 ± 0,889 g/L, obtida através do ajuste dos dados experimentais. As análises de inibição por produto na enzima celulase de Trichoderma reesei com bagaço de cana-de-açúcar mostraram que a glicose e a xilose reduziram a velocidade inicial de reação sem ocasionar uma redução considerável na velocidade máxima de formação de celobiose, indicando um mecanismo de inibição competitiva, onde a constante de inibição 14,950 ± 0,737 e 19,800 ± 3,143 g/L para glicose e xilose respectivamente. A hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar submetido a pré-tratamento organossolve catalisada pela enzima celulase exibiu um perfil cinético bastante diferente do perfil clássico de Michaelis Menten. A velocidade de formação de celobiose Vo apresentou um máximo quando a concentração de celulose foi aproximadamente de 10 g/L, e diminuiu com o aumento da concentração; este comportamento foi atribuído ao efeito sólido

Abstract: The aim of this work was to study the mechanism of product inhibition in the enzymatic hydrolysis process of sugarcane bagasse with ?-glucosidase enzyme from Aspergillus niger and the commercial complex Celluclast 1.5L from Trichoderma reesei. The substrates used in the experiments were...

Abstract: The aim of this work was to study the mechanism of product inhibition in the enzymatic hydrolysis process of sugarcane bagasse with ?-glucosidase enzyme from Aspergillus niger and the commercial complex Celluclast 1.5L from Trichoderma reesei. The substrates used in the experiments were cellobiose, bagasse sugarcane submitted to hydrothermal pretreatment (HB) and organosolv (OB). It was used glucono-?-lactone as an inhibitor of ?-glucosidase enzyme present in cellulolytic complex in order to avoid conversion of cellobiose into glucose in the reaction medium. The glucono-?-lactone concentration and incubation time with the enzyme cocktail were determined by a factorial design 32. To determine the kinetics of product inhibition of ?-glucosidase enzyme and Celluclast 1.5L tests were performed under the following conditions: cellobiose concentration (substrate) from 0.5 to 10 g / L and 0-10 g / L glucose (inhibitor); pretreated biomass from 0.1 to 8% w / v (substrate), xylose 0-10 g / L (inhibitor) and glucose 0-60 g / L (inhibitor), respectively. The experiments were performed at pH 4.8 for 1 h, 50 ° C, agited at 150 rpm and enzyme loading set at 0.0767 CBU / mL for the study of inhibition by glucose in ?-glucosidase enzyme and 50 FPU / mL for the study of inhibition by glucose and xylose in cellulase enzyme. During the hydrolysis were collected 1ml aliquots of the liquid liquid and concentration of the released carbohydrates was determined on a HPLC system. The glucose inhibition study in Aspergillus niger ?-glucosidase (Novozym188) with D (+) - Cellobiose as substrate revealed that this enzyme is inhibited by glucose competitively. The inhibition constant Ki was 3.825 ± 0.889 g / L, obtained by adjusting the experimental data. Product inhibition analyzes on Trichoderma reesei cellulase enzyme with sugarcane bagasse showed that glucose and xylose reduced the initial rate without causing a considerable reduction in maximum velocity of cellobiose formation, indicating competitive inhibition, where the inhibition constant it is 14,950 ± 0,737 and 19,800 ± 3,143 g / L for glucose and xylose respectively. The enzymatic hydrolysis of the sugarcane bagasse submitted to organosolve pre-treatment exhibited a kinetic profile quite different from the classic profile of Michaelis Menten. The velocity of cellobiose formation Vo showed a maximum when the cellulose concentration was approximately 10 g/L, and decreased with increasing substrate concentration; this behavior was attributed to effect of solid

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