Resumo: A via da sacaropina é considerada a principal rota para o catabolismo de lisina em mamíferos, na qual a enzima Aminoadipato Semialdeído Sintase (AASS) catalisa a oxidação da lisina ao aminoadipato semialdeído (AASA). Este é imediatamente oxidado a ácido aminoadípico (AAA) por ação da enzima Aminoadipato Semialdeído Desidrogenase (AASADH, codificada pelo gene aldh7a1). Em humanos, mutações no gene AASS são a causa da hiperlisinemia, um erro inato do metabolismo, porém benigno. Por outro lado, mutações no gene Aldh7a1 causam Epilepsia Dependente de Piridoxina (PDE), na qual o acúmulo de AASA e sua forma cíclica, Piperideine-6 Carboxilato (P6C), são consideradas as principais causas desta doença. Estes compostos causam depleção de Piridoxal-5¿ fosfato (PLP) do organismo por meio da formação de produtos de condensação com o composto P6C. Apesar de existir uma rota alternativa de degradação de lisina (conhecida como via do pipecolato), hipotetizamos que os níveis elevados de AASA/P6C observados no plasma e urina de pacientes com PDE decorrem, principalmente, da atividade da via da sacaropina, especificamente da enzima AASS. Durante o presente trabalho de doutorado, desenvolvemos um novo método quantitativo de espectrometria de massas (LC-MS/MS) que permitiu a analise dos metabólitos da degradação de lisina em plasma e tecidos de camundongos. Como resultado da quantificação de metabólitos e também experimentos de rastreio de 15N (usando-se injeção de lisina marcada no nitrogênio ? ou ?) sugerimos a enzima AASS como a principal enzima de degradação de lisina do organismo. Desta forma, esta enzima seria a responsável pela síntese da maior parte do AASA/P6C acumulado em pacientes de PDE e, sendo que esta enzima é principalmente hepática e renal, sugerimos estes órgãos como os principais sítios de produção destes compostos tóxicos. Adicionalmente, a ideia de que a via do pipecolato possui apenas um papel minoritário no metabolismo geral de lisina é também suportada por esses experimentos, onde cerca da metade deste composto circulante provavelmente se origina da via da sacaropina. Este efeito também foi observado e discutido por nós em outros modelos biológicos como bactéria (Ruegeria pomeroyi) e plantas (Zea mays). Sugerimos, portanto, que a escolha da AASS como alvo terapêutico para desenvolvimento de inibidores seja uma nova alternativa para tratamento de PDE, pois seria observada redução dos níveis tóxicos de AASA/P6C. Observamos que o uso de shRNA para realizar knockdown da expressão do gene aass em células HEK293T não resultou em nenhum fenótipo detrimental e também não causou indução dos genes da via do pipecolato. Ao estudarmos células primárias de cinco distintos pacientes de PDE (modelo de fibroblastos de pele) observamos que estas células possuem maior sensibilidade à presença de Lisina ao meio de cultura se comparadas à células normais. Como prova de conceito observamos que o knockdown da expressão de aass usando shRNA restaura a sobrevivência das células PDE na presença de altos níveis de lisina. Isso pode sugerir o uso de ASO (Anti-sense Oligonucleotides) ou inibidores da atividade da AASS para tratamento da PDE. Para promover melhor entendimento da bioquímica e biologia estrutural deste novo alvo terapêutico, expressamos, purificamos e obtivemos com sucesso a estrutura cristalográfica do domínio Sacaropina Desidrogenase (SDH) da enzima AASS humana. Propriedades cinéticas e bioquímicas da enzima foram estudadas, bem como foram realizados ensaios de screening de ligantes por desnaturação térmica e ensaios de atividade. Foram feitas várias rodadas de desenho computacional de inibidores baseados na estrutura do sítio ativo com o intuito de usar esta tecnologia para desenhar compostos que atuem competindo com a sacaropina pelo sítio ativo Ver menos

Abstract: The saccharopine pathway is considered the main route for lysine catabolism in higher eukaryotes. In this pathway, the enzyme aminoadipate-semialdehyde synthase (AASS) catalyzes the oxidation of lysine into aminoadipic semialdehyde (AASA). The latter is immediately oxidized to aminoadipic acid (AAA) by aminoadipic semialdehyde dehydrogenase (AASADH). In humans, mutations affecting AASS activity lead to hyperlysinemia, a benign inborn error of metabolism. In contrast, mutations affecting AASADH activity cause pyridoxine dependent epilepsy (PDE), in which the accumulation of AASA and its cyclic form piperideine-6-carboxylate (P6C) are considered the main pathogenic drivers of this disease as it depletes pyridoxal 5?-phosphate (PLP) by formation of Knoevenagel condensation products. Although there exist another lysine catabolic route known as the pipecolate pathway, we hypothesize that the elevated plasma and urine levels of AASA/P6C observed in PDE patients arises predominantly from the saccharopine pathway. In the work comprising this thesis, a series of experiments were carried out employing diverse bilological models to study lysine catabolism to AAA. In addition, a new quantitative LC-MS/MS method was developed, which allowed the analysis of lysine catabolism products in mouse plasma and tissues. The quantification of lysine metabolites and the tracking of N15-labelled lysine suggest that AASS is the main enzyme of lysine degradation. We suggest that the primary source of pathogenic accumulation of AASA/P6C is the liver and the kidney, since they present high levels of AASS activity. In addition, we demonstrate that the pipecolate pathway plays only a minor role in the overall figure of lysine oxidation to AAA. The idea of the predominant role of the sacharopine pathway in lysine degradation was reinforced by studies performed in bacteria and plants and also from the observation that a significant proportion of the circulating pipecolate is actually produced from the saccharopine pathway. Taken together these results may support the hypothesis that targeting AASS inhibition or AASS down-regulation at transcription level would reduce the toxic levels of AASA/P6C and this may result in a better outcome for PDE. We then knocked-down AASS in HEK293T cells and observed that this does not imply in any detrimental phenotype. Then we used primary skin fibroblasts from PDE patients and observed that these cells display reduced viability in the presence of high lysine levels when compared to skin fibroblasts derived from normal children. As proof-of-concept, we recovered the normal cell survival in the presence of high lysine levels by knocking-down AASS expression in skin fibroblasts obtained from PDE patients, which suggest that inhibition of AASS prevents accumulation of AASA/P6C and thus improves cell performance. This may potentially be a new method to treat PDE. In order to understand the biochemistry and structural biology of human AASS as a tool for the design of an enzyme inhibitor, we expressed, purified and obtained the crystallographic structure by X-ray diffraction at 2.6 Å of the saccharopine dehydrogenase (SDH) domain of human AASS. The solved structure consists on a homodimer bound to the cofactor NAD+. Structure-based drug design approaches are being used to design potential ligands that may act as competitive inhibitors to saccharopine binding site Ver menos