Orientador: Sônia Maria Alves Bueno

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química

Resumo: Anticorpos (imunoglobulinas) são glicoproteínas expressas pelo sistema imunológico de vertebrados em resposta à agentes patógenos. Devido à sua especificidade em reconhecer um antígeno, anticorpos são empregados nas áreas analítica, diagnóstica, biossensores, proteômica e terapêutica. Seu...

Resumo: Anticorpos (imunoglobulinas) são glicoproteínas expressas pelo sistema imunológico de vertebrados em resposta à agentes patógenos. Devido à sua especificidade em reconhecer um antígeno, anticorpos são empregados nas áreas analítica, diagnóstica, biossensores, proteômica e terapêutica. Seu uso tem crescido nas últimas décadas, movimentando um mercado de U$ 130,9 bilhões em 2020. Na área terapêutica são requeridas grandes doses de preparações de anticorpos por paciente, portanto estudos de processos de purificação de baixo custo em larga escala são relevantes. Este trabalho visou o desenvolvimento de um monolito macroporoso, preparado pela técnica de crio-polimerização (criogel), para ser empregado como fase estacionária em cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) com a finalidade de purificar imunoglobulina G a partir do soro bovino (bIgG). O criogel foi sintetizado utilizando monômeros de acrilamida, bisacrilamida, alil diglidil éter e alginato de sódio, sendo denominado PAAm-Alg-AGE. Em seguida, foram derivatizados com o quelante tridentado ácido iminodiacético (IDA) e os íons metálicos Cu2+ e Ni2+ foram imobilizados, visando investigar (por eletroforese SDS-PAGE e imunodifusão radial) a capacidade de adsorver bIgG de forma seletiva. Quando na condição tamponante MOPS 25 mmol/L em pH 6,5, o criogel com Cu2+ imobilizado capturou bIgG com rendimento de 66%, pureza de 78% e fator de purificação de 5,57. Nas mesmas condições, o criogel controle (PAAm-Alg-AGE-IDA) adsorveu bIgG com 81% de rendimento, pureza de 84% e fator de purificação de 5,64. As curvas de ruptura indicaram que a seletividade não foi afetada após a saturação dos adsorventes, resultando em purezas de 75,31% e 88,06% e fatores de purificação de 6,91 e 9,55, para os criogéis IDA-Cu2+ e controle, respectivamente. A capacidade máxima de adsorção (q*) e a constante de dissociação foram determinadas a partir das isotermas de adsorção, empregando os modelos matemáticos de Langmuir e Langmuir-Freundlich. Os resultados demonstraram afinidade característica de ligantes pseudobioespecíficos (10-6 mol/L) e q* de 51,49 ± 6,84 e 129,69 ± 6,44 mg bIgG/g de criogel seco, para o criogéis sem e com Cu2+ imobilizado, respectivamente. Por experimentos cinéticos, foi observado a natureza da adsorção, sendo a taxa governada por efeitos difusivos para o adsorvente controle e, na presença de Cu2+, a adsorção é governada pela formação do complexo IDA-Cu2+-bIgG. Os resultados aqui descritos expressam o potencial dos adsorventes em capturar IgG do soro bovino, principalmente quando empregado em cromatografia de troca iônica, utilizando o agente quelante IDA como ligante

Abstract: Antibodies (immunoglobulins) are glycoproteins expressed by the immune system of vertebrates in response to the invasion of extracellular pathogens. Due to their specificity affinity for an antigen, antibodies are applied in analytical and therapeutic area, in diagnostic tests, as a...

Abstract: Antibodies (immunoglobulins) are glycoproteins expressed by the immune system of vertebrates in response to the invasion of extracellular pathogens. Due to their specificity affinity for an antigen, antibodies are applied in analytical and therapeutic area, in diagnostic tests, as a biosensor, and in proteomics. Its use has grown over the last decades, moving an amount of U$ 130,9 billion in 2020. In the therapeutic area, large doses of antibody are required per patient, therefore studies of low-cost purification processes for scale-up are relevant. This work aimed the development of a macropouros monolith synthetized by the cryo-polymerization technique (cryogel) to be used as a stationary phase in Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography (IMAC) in order to purify immunoglobulin G from bovine serum (bIgG). Depending on the conditions employed, the technique has high selectivity and low cost in comparison to the unit operations commonly employed. For the production of the cryogel, monomers of acrylamide, biscarylamide, allyl diglycil ether and sodium alginate was used and the monolith obtained was called PAAm-Alg-AGE. The tridentate agent IDA, Cu2+ and Ni2+ metals were immobilized to investigate the selectivity in IgG adsorption by SDS-PAGE electrophoresis and radial immunodiffusion. The results indicated that when MOPS 25 mmol/L at pH 6.5 was used, the cryogel with Cu2+ immobilized, captured bIgG with 66% yield, 78% purity and 5.57 purification factor. In the same conditions, the control cryogel (PAAm-Alg-AGE-IDA) adsorbed bIgG with 81% yield, 84% purity and 5.64 purification factor. The breakthrough curves showed that the selectivity of the cryogel was not affected by the saturation, resulting in purities of 75.31% and 88.06% and purification factors of 6.91 and 9.55 for PAAm-Alg-AGE-IDA-Cu2+ and the control, respectively. The maximum adsorption capacity (q*) and the dissociation constant of the adsorbents were determined by the adsorption isotherms adjusting the Langmuir and Langmuir-Freundlich models. The results indicated affinity characteristic of pseudbiospecific ligands and (10-6 mol/L) and q* of 46.51 ± 2.37 and 126.43 ± 4.03 mg bIgG / g of dry cryogel, for cryogels without and with immobilized Cu2+, respectively. The adsorption kinetics allowed to determine the nature of bIgG adsorption in the adsorbents, showing that the rate is governed by diffusive effects for the control adsorbent, and in the presence of Cu2+, is governed by the formation of the IDA-Cu2+-bIgG complex. This set of results demonstrated the potential of the adsorbents to capture IgG from bovine serum, mainly when applied as ion exchange matrix, using IDA as a ligand

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