Orientadores: Marisa Masumi Beppu, Bradley David Olsen

Tese (doutorado)- Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química

Resumo: A funcionalização de superfícies com recobrimentos nanoestruturados tem sido explorada para superar desafios biotecnológicos, da entrega direcionada de fármacos à captura seletiva de analitos para diagnóstico. Proteínas recombinantes tem um papel de destaque no desenvolvimento de superfícies...

Resumo: A funcionalização de superfícies com recobrimentos nanoestruturados tem sido explorada para superar desafios biotecnológicos, da entrega direcionada de fármacos à captura seletiva de analitos para diagnóstico. Proteínas recombinantes tem um papel de destaque no desenvolvimento de superfícies bioativas, permitindo o desenvolvimento de macromoléculas com as funcionalidades desejadas. A técnica layer-by-layer (LbL) tem se popularizado como uma estratégia simples e versátil para a funcionalização de superfícies com mínimas restrições quanto à superfície e aos materiais depositados. Ambas as estratégias, no entanto, requerem esforços significativos para determinar as condições adequadas produzir novos materiais. Esta tese teve como objetivo facilitar a produção de materiais à base de biopolímeros e proteínas recombinantes, a partir de métodos automatizados de alta produtividade (high-throughput). Inicialmente, a técnica LbL foi adaptada para a deposição de filmes multicamadas em placas de 96 de poços, permitindo a investigação de diferentes condições de deposição dos recobrimentos na mesma batelada. Este método mostrou-se efetivo para a produção de recobrimentos de polissacarídeos, indicando que a quantidade de grupos amino e carboxílicos livres dos recobrimentos varia de acordo com o pH de deposição. Filmes híbridos à base de polipeptídios do tipo elastina (ELPs) e polissacarídeos, formados a partir de interações eletrostáticas, demostraram que condições de pH que promoveram baixos graus de ionização dos polieletrólitos e a presença de aminoácidos com resíduos hidrofóbicos nas ELPs favoreceram o crescimento dos recobrimentos. Esta tese também explorou a versatilidade no design de ELPs para investigar uma biblioteca de interações complementares para a formação de recobrimentos multicamadas. Interações do tipo Spy-Tag/Spy-Catcher e ZE/ZR (ou zíperes de leucina), dentre outras, mostraram-se capazes de direcionar a deposição auto-organizada dos recobrimentos. Recobrimentos formados por interações Spy-Tag/Spy-Catcher também apresentaram significativa estabilidade em diversas condições de pH (3.0 - 12.0) e força iônica (5.0 mol/L NaCl) que dissociaram filmes formados por interações eletrostáticas. O método high-throughput-LbL também foi usado para investigar o efeito das condições de deposição na incorporação e liberação de uma molécula modelo (calceína) em recobrimentos de poli(ácido acrílico)/poli(alilamina). Neste caso, maiores valores de pH (> 8.5) e a presença de sais como NaCl ou MgCl2 (ambos a 0.05 mol/L) nas soluções polieletrolíticas favoreceram a incorporação de calceína nos recobrimentos. O método de incorporação também alterou a morfologia dos recobrimentos e os mecanismos de liberação de calceína, resultando em taxas de liberação mais lentas para incorporação durante a deposição das multicamadas. Por fim, esta tese também explorou estratégias high-throughput para testar a síntese de proteínas recombinantes. Protocolos de biologia molecular, da transformação à biossíntese das proteínas, foram automatizados, permitindo testar dezenas de combinações de linhagem celular-vetor em cada experimento. Foram desenvolvidos ainda protocolos automatizados para a quantificação de proteína total (Bradford) e específica (6×His-tag immunoassay), auxiliando na triagem das condições adequadas para a biossíntese de mCherry (proteína modelo). De modo geral, esta tese destacou o uso de métodos high-throughput para facilitar o desenvolvimento de materiais à base de biopolímeros e proteínas que demandem inúmeras etapas de testagem e otimização, contribuindo para acelerar os ciclos de inovação na área de biotecnologia

Abstract: Surface functionalization has been explored to overcome biotechnologically relevant challenges, from the targeted drug delivery to the selective capture of bioactive agents for diagnosis. Recombinant protein plays an important role in designing bioactive surfaces by designing...

Abstract: Surface functionalization has been explored to overcome biotechnologically relevant challenges, from the targeted drug delivery to the selective capture of bioactive agents for diagnosis. Recombinant protein plays an important role in designing bioactive surfaces by designing macromolecules with the desired functionalities. The layer-by-layer (LbL) technique became a popular strategy for surface functionalization with minimal restrictions regarding the coated surface and the materials deposited. Nevertheless, both strategies demand substantial efforts to determine the appropriate conditions to prepare the newly designed materials. This thesis aimed to streamline the production of biopolymer- and recombinant protein-based materials through high-throughput methods. At first, the LbL method was adapted to deposit multilayer films on 96-well plates, enabling one to investigate different assembly conditions into the same batch. This method effectively produced polysaccharide-based films, indicating the dependence of free amino and carboxylate groups on multilayers to the assembly pH conditions. Hybrid polysaccharide/recombinant elastin-like polypeptides (ELPs) were also assembled based on electrostatic interactions. ELP variants containing a higher number of hydrophobic residues and assembly pH conditions that promoted lower ionization degrees of both polyelectrolytes led to higher film growth. This thesis also explored protein engineering's versatility for designing a library ELPs fused with complementary isopeptide binding domains for self-assembly LbL films. Spy-Tag/Spy-Catcher and leucine zipper ZE/ZR interactions, among others, were effective to drive the self-assembly deposition of multilayer films. Spy-Tag/Spy-Catcher also led to resistant multilayers over a wide range of pH (3.0 – 12.0) and ionic strength (5.0 mol/L NaCl), which may disassemble traditional polyelectrolyte-based multilayers. The high-throughput-LbL method was also used to investigate the role of film assembly conditions on the loading and release of a model drug molecule (calcein) on poly(acrylic acid)/poly(allylamine hydrochloride) multilayer films. Higher values of pH (> 8.5) and the presence of NaCl or MgCl2 salts (both at 0.05 mol/L) in the polyelectrolyte solutions favored the model drug loading in multilayer films. The drug loading method also affected the film morphology and drug transport mechanisms, leading to slower drug release rates for films loaded during polyelectrolyte multilayer deposition. Finally, this thesis explored the use of the high-throughput approach for recombinant protein test expression. Molecular biology protocols, from cell transformation to protein biosynthesis, were automated to screen tens of different cell strain-vector combinations per batch. The study also focused on automating analytical total (Bradford) and histidine-tagged (immunoassay) protein quantification to determine the most favorable condition for mCherry biosynthesis (model protein). Overall, this thesis sheds light on using high-throughput methods to facilitate the development of biopolymer- or protein-based materials that demand intense testing and optimization, contributing to accelerating the innovation cycles in the biotechnology arena

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