Orientador: Sonia Maria Alves Bueno

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química

Resumo: As imunoglobulinas G (IgG) são expressas pelo sistema imunológico de seres vertebrados. Devido à alta especificidade da IgG e seus fragmentos, essas biomoléculas são empregadas em diversas aplicações médicas, farmacêuticas e analíticas. Tais aplicações requerem preparações homogêneas desta...

Resumo: As imunoglobulinas G (IgG) são expressas pelo sistema imunológico de seres vertebrados. Devido à alta especificidade da IgG e seus fragmentos, essas biomoléculas são empregadas em diversas aplicações médicas, farmacêuticas e analíticas. Tais aplicações requerem preparações homogêneas desta imunoglobulina e, por serem tradicionalmente obtidas a partir do soro, plasma ou do sobrenadante de cultura celular, processos efetivos de purificação são fundamentais, acarretando em alto custo para obtenção do bioproduto. Seu elevado custo tem impulsionado os avanços em técnicas cromatográficas, principalmente as de cromatografia de pseudobioafinidade, devido à possibilidade de obtenção do produto com alto grau de pureza, menor custo e reduzido número de etapas. Aliado a isso, a introdução de leitos monolíticos poliméricos como suporte sólido para imobilização do ligante, agregou uma série de vantagens ao processo cromatográfico de purificação. Esses suportes podem ser sintetizados com diferentes monômeros e, quando obtidos pela técnica de criopolimerização, apresentam macroporos interconectados proporcionando fluxo predominantemente convectivo, sendo essa sua principal vantagem. Com isso, o presente trabalho teve como objetivo sintetizar um criogel monolítico a base dos monômeros de acrilamida e alginato de sódio e os agentes reticulantes alil glicidil éter e bisacrilamida (PAAm-Alg-AGE), com o ligante pseudobioespecífico o-fosfo-L-tirosina (OPT) imobilizado (PAAm-Alg-AGE-OPT), e testar este adsorvente na purificação de IgG a partir do soro humano bem como na separação de seus fragmentos proteolíticos Fab e Fc. Em experimentos de purificação de IgG, a seletividade do adsorvente em diferentes condições cromatográficas foi avaliada por eletroforese SDS-PAGE. Na separação de fragmentos, a seletividade foi avaliada por eletroforese SDS-PAGE, Western Blot e imunodifusão radial. Os resultados indicaram que o adsorvente foi seletivo à IgG presente em soro humano na presença de Tris-HCl e Hepes, ambos a 10 e 25 mmol/L e pH 7,0. Curvas de ruptura indicaram capacidade de adsorção dinâmica de 24,91 ± 2,41 e 22,24 ± 0,21 mg de proteína total/g seca de criogel em Tris-HCl 10 mmol/L e Hepes 25 mmol/L, respectivamente, sendo também efetivo na separação entre os fragmentos Fab e Fc. Por imunodifusão radial, foi obtido adsorção de 73,61% e 82,61% dos fragmentos Fab alimentados em Tris-HCl 10 mmol/L e Hepes 25 mmol/L, respectivamente. O conjunto dos resultados apresentados evidenciaram o potencial em utilizar o ligante OPT imobilizado ao criogel monolítico de PAAm-Alg-AGE como leito fixo para purificação de IgG humana e seu fragmento Fab, por técnicas de cromatografia líquida de adsorção

Abstract: Immunoglobulins G (IgG) are expressed by the immune system of vertebrate beings. Due to the high specificity of IgG and their fragments, these biomolecules are employed on a variety of medical, pharmaceutical and analytical applications. All of them require homogenous preparations of...

Abstract: Immunoglobulins G (IgG) are expressed by the immune system of vertebrate beings. Due to the high specificity of IgG and their fragments, these biomolecules are employed on a variety of medical, pharmaceutical and analytical applications. All of them require homogenous preparations of immunoglobulins and because these biomolecules are traditionally obtained from serum, plasma or cell culture supernatant, effective purification processes are fundamental, resulting in a high-cost bioproduct. Its high cost has driven advances in chromatographic techniques, especially in pseudobioaffinity chromatography that make possible to obtain the product with a high degree of purity, lower cost and a reduced number of steps. In addition, the introduction of polymeric monolithic beds as a solid support for the ligand immobilization, has added many advantages to the chromatographic purification process. These supports can be synthesized with different monomers and, when obtained by the cryopolymerization technique, they show interconnected macropores providing predominantly convective flow, which is their main advantage. Thereby, the aim of this work was to synthesize a monolithic cryogel based on acrylamide and sodium alginate monomers and allyl glycidyl ether and bisacrylamide crosslinking agents (PAAm-Alg-AGE) with the pseudobiospecific ligand o-phospho-L-tyrosine (OPT) immobilized (PAAm -Alg-AGE-OPT), and to test this adsorbent in the purification of IgG from the human serum as well as in the separation of its Fab and Fc proteolytic fragments. In IgG purification experiments, the selectivity of the adsorbent under different chromatographic conditions was evaluated by SDS-PAGE electrophoresis. For the separation of the fragments, the selectivity was evaluated by SDS-PAGE electrophoresis, Western Blot, and radial immunodiffusion. The results indicated that the adsorbent was selective for IgG present in human serum in the presence of Tris-HCl and Hepes, both at 10 and 25 mmol/L and pH 7.0. The breakthrough curves under the same conditions indicated a dynamic adsorption capacity of 24.91 ± 2.41 and 22.24 ± 0.21 mg total protein/g dry cryogel in Tris-HCl 10 mmol/L and Hepes 25 mmol/L, respectively. The cryogel was also effective in separating the proteolytic fragments Fab and Fc. Adsorption of 73.61% and 82.61% of the Fab fragments fed on Tris-HCl 10 mmol/L and Hepes 25 mmol/L, respectively, was obtained by radial immunodiffusion. All of these results evidenced the potential to use the ligand OPT immobilized to a monolithic cryogel of PAAm-Alg-AGE as a fixed bed for purification of human IgG and its Fab fragment by adsorption liquid chromatography

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