Orientador: Helia Harumi Sato

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos

Resumo: A L-asparaginase é utilizada em alimentos para diminuir o conteúdo de acrilamida, um carcinógeno formado em alimentos contendo L-asparagina e açúcares redutores submetidos a tratamento térmico a altas temperaturas, sem comprometer os aspectos sensoriais e nutricionais. O objetivo deste...

Resumo: A L-asparaginase é utilizada em alimentos para diminuir o conteúdo de acrilamida, um carcinógeno formado em alimentos contendo L-asparagina e açúcares redutores submetidos a tratamento térmico a altas temperaturas, sem comprometer os aspectos sensoriais e nutricionais. O objetivo deste trabalho foi selecionar uma linhagem de Aspergillus sp. produtora de L-asparaginase, otimizar os componentes do meio de fermentação e as condições de cultivo, para posterior produção, purificação, caracterização e aplicação da L-asparaginase em grãos de café para redução do teor de acrilamida. Quatro linhagens de fungos, A. niger IOC 2016, A. niger IOC 0203, A. oryzae IOC 3924 e A. oryzae IOC 3999, apresentaram teste qualitativo positivo indicativo de produção da L-asparaginase. No entanto, verificou-se que somente as linhagens de A. oryzae IOC 3999 e A. niger IOC 0203 produziram L-asparaginase, 448,0 U/mL e 85,1 U/mL, respectivamente, por fermentação submersa. Para aumentar a atividade enzimática do processo fermentativo foi utilizado uma estratégia sequencial de otimização dos parâmetros de fermentação obtendo-se 1443,57 U/mL para L-asparaginase de A. oryzae IOC 3999 após 48h e 1960,14 U/mL para L-asparaginase de A. niger IOC 0203 após 24h de fermentação. As L-asparaginases de A. oryzae IOC 3999 e A. niger IOC 0203 foram purificadas 2,11 e 2,43 vezes, respectivamente utilizando ultrafiltração por membrana de 30 kDa e cromatografia em coluna de exclusão molecular Sephadex G100. A L-asparaginase purificada de A. oryzae IOC 3999 apresentou atividade específica de 739,73 U/mg de proteína e massa molecular de 25,1 kDa, enquanto a enzima purificada de A. niger IOC 0203 apresentou 2304,18 U/mg de proteína e massa molecular de 37,7 kDa estimada por SDS-PAGE. Em relação às características bioquímicas, a L-asparaginase de A. oryzae IOC 3999 apresentou atividade ótima a 60 °C e pH 5, enquanto que a enzima de A. niger IOC 0203 apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7. Ambas as enzimas apresentaram elevada afinidade com a L-asparagina. Entre os íons metálicos testados, Mg2+, Fe2+, Fe3+, Co2+ e Mn2+, na concentração final de 1 mMol/L, ativaram a L-asparaginase de A. oryzae IOC 3999, enquanto que Mn2+, Fe2+, Hg2+, Mg2+ e Zn2+, na concentração de 1 mMol/L, ativaram a L-asparaginase de A. niger IOC 0203. No estudo da aplicação das L-asparaginases, os grãos de café arábica foram submetidos à um pré-tratamento térmico sob vapor a 100°C por 35 minutos. Após o tratamento térmico, as amostras de grãos de café foram misturadas com solução de 80 U/mL de L-asparaginase de A. oryzae IOC 3999 e A. niger IOC 0203, separadamente, e incubadas por 60 minutos a 50 °C. Em seguida, os grãos foram secos e torrados. A porcentagem de redução de acrilamida em grãos de café tratados com as preparações de L-asparaginases purificadas de A. oryzae IOC 3999 e A. niger IOC 0203 foram de 9,08% e 7,03%, respectivamente. Palavras-chaves: L-asparaginase, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, acrilamida, café

Abstract: L-asparaginase is used in foods to decrease the content of acrylamide, a carcinogen formed in foods containing L-asparagine and reducing sugars subjected to heat treatment at high temperatures, without compromising sensory and nutritional. The objective of this work was to select a strain...

Abstract: L-asparaginase is used in foods to decrease the content of acrylamide, a carcinogen formed in foods containing L-asparagine and reducing sugars subjected to heat treatment at high temperatures, without compromising sensory and nutritional. The objective of this work was to select a strain of Aspergillus sp. producer of L-asparaginase, optimize the components of the fermentation medium and the cultivation conditions, for later production, purification, characterization and application of L-asparaginase in coffee beans to reduce the acrylamide content. Four fungal strains, Aspergillus niger IOC 2016, A. niger IOC 0203, Aspergillus oryzae IOC 3924, and A. oryzae IOC 3999, presented positive for the qualitative test, indicating possible L-asparaginase production. However, under submerged fermentation, only A. oryzae IOC 3999 and A. niger IOC 0203 produced L-asparaginase presenting 448.0 U/mL and 85.1 U/mL, respectively. To increase the enzymatic activity of the fermentation process, a sequential strategy of optimization was performed. L-asparaginase from A. oryzae IOC 3999 and A. niger IOC 0203 produced 1443.57 U/mL (after 48 h of fermentation) and 1960.14 U/mL (after 24 h of fermentation), respectively. The L-asparaginases from A. oryzae IOC 3999 and A. niger IOC 0203 were purified 2.11 and 2.43 fold, respectively using 30 kDa ultrafiltration membrane and Sephadex G100 molecular exclusion column chromatography. The purified L-asparaginase of A. oryzae IOC 3999 showed specific activity of 739.73 U/mg protein and molecular mass of 25.1 kDa, while the purified enzyme of A. niger IOC 0203 presented 2304.18 U/mg protein and molecular mass of 37.7 kDa estimated by SDS-PAGE. Regarding the biochemical characteristics, the purified enzyme of A. oryzae IOC 3999 showed optimal activity at 60 °C and pH 5, while the L-asparaginase from A. niger IOC 0203 showed optimal activity at 50 °C and pH 7. Both enzymes showed high affinity for L-asparagine. Among the metal ions tested, Mg2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, and Mn2+, in concentration of 1 mMol/L, activated L-asparaginase from A. oryzae IOC 3999, while Mn2+, Fe2+, Hg2+, Mg2+, and Zn2+, in concentration of 1 mMol/L, activated L-asparaginase from A. niger IOC 0203. In the application study, arabica coffee beans were subjected to a thermal pre-treatment under steam at 100 °C for 35 min. After heat treatment, the coffee beans samples were separately mixed with 80 U/mL of purified enzyme solutions and incubated for 60 min at 50 °C. Then, the beans were dried and roasted. The percentage of acrylamide reduction in coffee beans treated with the preparations of purified L-asparaginases from A. oryzae IOC 3999 and A. niger IOC 0203 was 9.08% and 7.03%, respectively. Keywords: L-asparaginase, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, acrylamide, coffee

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